Визуализация Одноместный молекулярных комплексов В Vivo Использование дополнительных флуоресцентной микроскопии
Summary
Здесь мы показываем, протоколы для выполнения одной молекулы флуоресцентной микроскопии на живые клетки бактерий чтобы функциональных молекулярных комплексах для обнаружения, отслеживания и количественно.
Abstract
Полное понимание механизмов живых клеток может быть достигнуто только путем исследования основных процессов, которые вызывают и прямой событий на клеточном уровне. На сегодняшний день сдвига сложности биологических систем вызвало точное одиночных молекул экспериментов, чтобы быть слишком требовательным, сосредоточить внимание на изучении одной системы, использующие относительно сырая масса ансамбль среднего измерений. Тем не менее, многие важные процессы происходят в живой клетке на уровне одного или нескольких молекул, ансамбль измерений обычно маски стохастической и гетерогенный характер этих событий. Здесь, используя передовой оптической микроскопии и аналитические инструменты для анализа изображений мы покажем, как контролировать белков в пределах одной живой бактериальной клетки с точностью до отдельных молекул, и как мы можем наблюдать динамику внутри молекулярных комплексов в функционировании биологических машин. Методы имеют непосредственное отношение физиологически. Они минимально-пертурбативные и неинвазивные к биологическому исследуемого образца и полностью приспособлены для исследований в живой материал, функции, не доступны для других одиночных молекул подходы биофизики. Кроме того, биологических образцов, изучил все производят флуоресцентно с метками белка на уровнях, которые почти идентичны немодифицированные штаммов клетки ("геномной кодирования»), в отличие от более общих, но менее идеальный подход для генерации значительно больше белка, чем это происходит естественным ('плазмиды выражение'). Таким образом, фактические биологические образцы, которые будут изучены значительно ближе к природных организмов, и поэтому наблюдения более актуальными для реальных физиологических процессов.
Protocol
Discussion
Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не "за сдвига" ячейки для глядя на привязал бактерий, так как это может привести к нарушению функциональности жгутиковых моторов. Важно использовать клетки намного дольше, чем один раз на час стекло микроскопа, так как они могут стать кисло…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем рода пожертвования бактериальных штаммов из группы профессора Джудит Армитаж (Оксфордский университет, Великобритания) и профессор Конрад Mullineaux (Queen Mary Лондонского университета, Великобритания). IMD финансируется совместно отделом биохимии (Оксфордский университет) и OCISB; AR финансируется инженерным и физическим научным исследованиям Совета (EPSRC) DTC студенчества; ND финансируется из биотехнологии и биологических наук Исследовательского Совета (СИББН); MCL является финансируемых Королевского общества стипендий исследовательского университета.
References
- Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes. Nature. 443, 355-358 (2006).
- Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).
- Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay. Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).
- Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay. FEBS Lett. , 535-555 (2003).
- Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane. Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).
- Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane. Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).
- Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli. Biophys. 93, 294-302 (2007).
- Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells. Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).
