Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung
Summary
Regulierte Endozytose regelt die Zelloberflächenexpression Ebenen der Mehrheit der Membranproteinen. Hier nutzen wir reduzierbar, Membran impermeante Biotinylierungsreagenzien die endocytischen Rate der Dopamin-Transporter (DAT), ein polytoper Membranprotein zu messen. Das Verfahren ermöglicht eine einfache Methode zur Messung der Endozytose von den meisten Plasmamembranproteinen.
Abstract
Plasma-Membran-Proteine sind eine große, heterogene Gruppe von Proteinen, Rezeptoren, Ionenkanäle, Transporter und Pumpen umfasst. Die Aktivität dieser Proteine ist verantwortlich für eine Vielzahl von Schlüsselbegriffen zellulären Ereignissen, einschließlich Nährstoffzufuhr, zelluläre Erregbarkeit und chemische Signalisierung. Viele Plasmamembranproteinen werden dynamisch von endocytischen Menschenhandel, die Funktion von Proteinen moduliert durch die Veränderung Proteinoberfläche Ausdruck geregelt. Die Mechanismen, die Protein Endocytose zu erleichtern, sind komplex und nicht vollständig für viele Membranproteine verstanden. Um das Verständnis der Mechanismen, die die endocytischen Handel mit einem bestimmten Protein-Steuerung, ist es entscheidend, dass das Protein s endocytischen Rate präzise gemessen werden. Für viele Rezeptoren, sind direkte endocytischen Rate-Messungen häufig erreicht Verwendung markierter Rezeptor-Liganden. Doch für viele Klassen von Membranproteinen, wie etwa Transporter, Pumpen und Ionenkanäle, gibt es keine passende Ligand, mit dem die endocytischen Rate gemessen werden kann. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir eine reversible Biotinylierung Methode, die wir einsetzen, um die Dopamin-Transporter (DAT) endocytischen zu messen. Diese Methode stellt eine einfache Methode zur Messung von Internalisierung Raten und kann leicht für den Handel mit Studien der meisten Membranproteine eingesetzt werden.
Protocol
Discussion
Häufige Probleme: Das häufigste Problem, dass bei diesen Versuchen ergibt sich ist schlecht Streifen Effizienz. Die Effizienz des Streifens ist von entscheidender Bedeutung in der Lage, die Ergebnisse zu interpretieren. Sofern der Streifen wurde hocheffiziente, ist es nicht möglich festzustellen, dass jeder biotinylierten Proteinen in die Internalisierung Gassen, waren in der Tat, verinnerlicht von der Oberfläche. Strips ≥ 90% Wirkungsgrad sind optimal, und wir verwerfen Ergebnisse, wenn die Streifen unter …
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH geförderten # DA15169 zu HEM
References
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent. Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).
