受调控的内吞作用决定了大多数膜蛋白在细胞表面的表达水平。本文中，我们利用可还原且不能透过膜的生物素化试剂，测定多拓扑膜蛋白——多巴胺转运体（DAT）的内吞速率。该方法为测定大多数质膜蛋白内吞速率提供了一种简便直接的途径。
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本文内容
摘要
摘要
质膜蛋白是一类庞大且多样的蛋白质，包括受体、离子通道、转运蛋白和泵。这些蛋白的活性介导多种关键的细胞事件，如营养物质的递送、细胞兴奋性以及化学信号传导。许多质膜蛋白通过内吞运输实现动态调控，这种调控通过改变蛋白在细胞表面的表达水平来调节其功能。介导蛋白内吞的机制十分复杂，目前对许多膜蛋白而言仍不完全清楚。为了全面理解调控特定蛋白内吞运输的机制，精确测定该蛋白的内吞速率至关重要。对于许多受体而言，通常可通过标记的受体配体直接测定其内吞速率。然而，对于转运蛋白、泵和离子通道等许多类型的膜蛋白，尚无便捷的配体可用于测定其内吞速率。在本报告中，我们描述了一种可逆生物素标记方法，用于测定多巴胺转运蛋白（DAT）的内吞速率。该方法为测量内化速率提供了一种简便的途径，并可广泛应用于大多数膜蛋白的运输研究。
方案
操作概述：
采用该方法，在运输受限条件（即低温）下，使用膜非渗透性、二硫键偶联的生物素标记试剂（sulfo-NHS-SS-生物素）对细胞表面蛋白的可及胞外赖氨酸残基进行共价标记（示意图见图1）。一组细胞转移至允许运输的条件（37°C），使生物素标记的蛋白发生内化；另一组细胞则保持在低温下作为对照，用于：1）确定时间为0时的总表面蛋白量，以及2）脱标对照。经过短暂的内化期后，细胞重新转移回低温环境以终止内化过程，并通过还原剂处理细胞去除残留的表面生物素，该还原剂可裂解二硫键偶联的生物素。来源于细胞表面并已内化的生物素化蛋白则在脱标步骤中受到保护，成为唯一保留的生物素化蛋白。细胞裂解后，利用链霉亲和素亲和层析分离生物素化蛋白，并通过定量免疫印迹检测目标蛋白。为确定内吞速率，将内化蛋白的量与时间为0时标记的总表面蛋白对照进行比较。我们已成功应用该方法测定神经元去甲肾上腺素1和多巴胺1-4转运体的内化速率。
详细实验步骤：
第1天：
- 将细胞接种于6孔板中，使其在第2天达到约80%汇合度。或者，若使用转染细胞，则应以适当密度转染，使其在测定内化速率时达到约80%汇合度。若细胞贴壁不牢固，应使用细胞黏附基质（如聚-D-赖氨酸）处理组织培养器皿，以防止在多次洗涤步骤中发生细胞脱落。
- 针对每种待....
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讨论
常见问题：这些实验中最常见的问题是 stripping 效率低下。stripping 效率对于结果的解读至关重要。除非 stripping 效率非常高，否则无法得出内化泳道中任何生物素标记的蛋白质确实是从细胞表面内化的结论。stripping 效率 ≥90% 为最佳，若效率低于此水平，我们将舍弃所有结果。图 3 展示了一个低效 stripping 的示例。请注意，stripping 泳道中的条带非常明显，对应的 stripping 效率为 34%。如果出现 stripping 效率低下的情况，可能是在添加到细胞前未 freshly 配制 TCEP 溶液；或者 TCEP 已降解，需要购买新的试剂。使用 TCEP 粉末而非溶液形式，可能有助于避免此问题。
可能的修改： 在本报告中，我们测量了多巴胺转运体（DAT）内化在最初10分钟内的相对速率，并将其与蛋白激酶C（PKC）激活期间的DAT内化速率进行了比较。另一种方法是通过将细胞在不同时间点进行温育，以测定绝对内化速率。尽管这种方法可能实现，但根据我们的经验，早期时间点的信号水平较低，加之实验间的变异性，导.......
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致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 DA15169，授予 H.E.M.。
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参考文献
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E.
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重印与许可
