Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm
Summary
Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.
Abstract
Plazma zarı proteinleri, reseptörler, iyon kanalları ve pompaları oluşan proteinlerin büyük bir, çeşitli grup. Faaliyet bu proteinlerin besin teslimat, hücresel heyecanlanma, kimyasal ve sinyalizasyon dahil olmak üzere önemli hücresel olayları, çeşitli sorumludur. Birçok plazma zarı proteinleri protein yüzey ekspresyonunu değiştirerek protein fonksiyonu modüle endositik kaçakçılığı, dinamik tarafından düzenlenir. Protein endositoz kolaylaştıracak mekanizmalar karmaşıktır ve birçok membran proteinlerinin tam olarak anlaşılmış değildir. Verilen bir protein endositik kaçakçılığı kontrol mekanizmaları tam olarak anlamak için, protein endositik oranı tam olarak ölçülebilir kritik öneme sahiptir. Birçok reseptörleri için doğrudan endositik hızı ölçümleri sıklıkla etiketli reseptör ligandlar kullanılarak elde edilir. Ancak, taşıyıcılar, pompalar ve iyon kanalları gibi birçok sınıflar, membran proteinlerinin, endositik hızını ölçmek için kullanılabilir uygun ligand var. Bu raporda, dopamin taşıyıcısı (DAT) endositik oranını ölçmek için kullandıkları bir geri dönüşümlü biyotinilasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, içselleştirme oranlarını ölçmek için basit bir yaklaşım sağlar ve kolay bir çoğu membran proteinlerinin kaçakçılığı çalışmaları için istihdam edilebilir.
Protocol
Discussion
Ortak sorunları: Bu deneylerde ortaya çıkan en sık karşılaşılan sorun, kötü şerit verimliliği . Şerit verimliliği sonuçları yorumlamak mümkün kritik. Şerit, son derece verimli olduğu sürece, içselleştirme şerit herhangi bir biotinlenmiş proteinler yüzeye içselleştirilmiş, aslında olduğu sonucuna varılması mümkün değildir. Şeritler ≥% 90 verimliliği en uygun olan ve şerit bu seviyenin altına düşerse herhangi bir sonuç atmak. Fakir bir şerit bir örnek Şekil 3'te g…
Acknowledgements
Bu çalışma # DA15169 HEM hibe NIH tarafından finanse edildi
References
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent. Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).
