Измерение плазматической мембраны Белки Endocytic Цены на Реверсивные биотинилирование
Summary
Регулируемые эндоцитоза управляет клеточной поверхности уровня экспрессии большинства мембранных белков. Здесь мы используем приводимым, мембраны impermeant реагентов биотинилирование для измерения скорости endocytic переносчика дофамина (DAT), polytopic белков мембраны. Метод обеспечивает прямой подход к измерению endocytic скорость большинства белков плазматической мембраны.
Abstract
Плазменные белки мембраны большая, разнообразная группа белков входят рецепторы, ионные каналы, транспортеры и насосы. Активность этих белков отвечает за целому ряду ключевых клеточных событий, включая доставку питательных веществ, клеточной возбудимости, и химических сигналов. Многие мембранные белки плазмы динамически регулируется endocytic торговлей людьми, который модулирует функции белка путем изменения экспрессии белка поверхности. Механизмы, обеспечивающие белка эндоцитоза, сложны и не до конца понимали многие мембранные белки. Для того чтобы полностью понять механизмы, которые управляют endocytic оборота данного белка, очень важно, чтобы скорость endocytic белка с точно измерена. Для многих рецепторов, прямые измерения скорости endocytic часто достигнуто использованием меченых лигандов рецепторов. Тем не менее, для многих классов мембранных белков, таких как транспортеры, насосы и ионные каналы, нет удобного лигандов, которые могут быть использованы для измерения endocytic ставки. В настоящем докладе мы опишем метод обратимой биотинилирование, что мы используем для измерения переносчика дофамина (DAT) endocytic ставки. Этот метод обеспечивает прямой подход к измерению интернализации ставки, и могут быть легко использованы для торговли исследования большинства белков мембраны.
Protocol
Discussion
Общие проблемы: Самая частая проблема, возникающая в этих экспериментах является низкая эффективность полосы. Эффективность полосы имеет решающее значение в том, чтобы уметь интерпретировать результаты. Если полоса была очень эффективной, это не возможно сделать вывод, что любой ?…
Acknowledgements
Эта работа финансировалась NIH грант № DA15169 к HEM
References
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent. Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).
