Ein Assay zur Messung der Aktivität von Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase
Summary
Die Aktivität der induzierbaren Lysin-Decarboxylase wird durch Umsetzung des Substrates L-Lysin und das Produkt Cadaverin mit 2,4,6-trinitrobenzensulfonic Säure-Addukte, die unterschiedliche Löslichkeit in Toluol Form überwacht.
Abstract
Escherichia coli ist ein Bakterium, das in der Lage enterischen wachsender über einen weiten Bereich von pH-Werten (pH 5 bis 9) ist 1 und, unglaublich, ist in der Lage, extreme Säure betont einschließlich Passage durch den Magen von Säugetieren, wo der pH-Wert fallen können, um so niedrig überleben wie pH 1 bis 02 Februar. Um ein so breites Spektrum von sauren pH Überleben, E. coli besitzt vier verschiedenen induzierbaren Aminosäure Decarboxylasen dass decarboxylieren ihrem Substrat Aminosäuren in ein Proton-abhängigen Weise überhöhen dadurch die internen pH-Wert. Die Decarboxylasen gehören Glutaminsäure Decarboxylasen GADA und GadB 3, der Arginin-Decarboxylase Adia 4, die Lysin-Decarboxylase LdcI 5, 6 und die Ornithindecarboxylase SPEF 7. Alle diese Enzyme nutzen Pyridoxal-5'-Phosphat als Co-Faktor 8 und Funktion zusammen mit der inneren Membran-Substrat-Produkt Antiporter dass Decarboxylierung Produkte mit dem externen Medium im Austausch für frisches Substrat 2 zu entfernen. Im Falle von LdcI, wird das Lysin-Cadaverin Antiporter genannt Cadb. Kürzlich haben wir festgestellt, das X-ray Kristallstruktur von LdcI bis 2,0 Å, und wir entdeckten ein neues kleines Molekül gebunden LdcI die strengen Response-Regulator Guanosin-5'-diphosphat, 3'-diphosphat (ppGpp) 14. Die strengen Reaktion tritt ein, wenn exponentiell wachsenden Zellen Nährstoffmangel oder eines einer Reihe von anderen betont 9 Erfahrungspunkte. Als Folge produzieren die Zellen ppGpp, die zu einer Signalkaskade ihren Höhepunkt in der Verlagerung von exponentiellem Wachstum bis zur stationären Phase das Wachstum 10 führt. Wir haben gezeigt, dass ppGpp ein spezifischer Inhibitor der LdcI 14 ist. Hier beschreiben wir die Lysin-Decarboxylase-Test aus dem Test von Phan et al modifiziert. 11, die wir verwendet haben, um die Aktivität von LdcI und die Wirkung der pppGpp / ppGpp diese Tätigkeit zu bestimmen. Die LdcI Decarboxylierung entfernt die α-Carboxygruppe von L-Lysin und produziert Kohlendioxid und das Polyamin Cadaverin (1,5-Diaminopentan) 5. L-Lysin und Cadaverin kann mit 2,4,6-trinitrobenzensulfonic (TNBS) bei hohen pH umgesetzt werden, um N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-Cadaverin) und N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-Lysin) zu generieren bzw. 11. Die TNP-Cadaverin aus der TNP-Lysin als der ehemalige löslich in organischen Lösungsmitteln wie Toluol, während letzteres nicht (siehe Abbildung 1) getrennt werden. Der lineare Bereich des Assays wurde empirisch ermittelt unter Verwendung von gereinigten Cadaverin.
Protocol
Discussion
In der Lysin-Decarboxylase-Test ist TNBS mit dem primären Aminen von L-Lysin und Cadaverin reagierte auf TNP-Lysin und TNP-Cadaverin Addukte (Abbildung 1). Durch die Anwesenheit der Carbonsäuregruppe auf TNP-Lysin, bleibt dieses Addukt in Wasser löslich ist, während der TNP-Cadaverin, ohne die Carbonsäuregruppe, ist in der Lage Aufteilung in Toluol 11. Diese Art von Test kann im weiteren Sinne auf andere Arten von Aminosäuren, wo der Verlust einer Carbonsäuregruppe tritt bei der Reaktion genutzt werden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Dr. Michael Cashel (National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA) für die Zusendung Bakterienstämme, Plasmide und notwendigen Protokolle. Wir danken Dr. John Glover (Department of Biochemistry, University of Toronto) für die Nutzung des SpecraMax Plattenlesegerät. Großbritannien ist der Empfänger einer Nationalen Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Postgraduate-Stipendium, ein kanadischer Institutes of Health Research Strategic Training Program in die Strukturbiologie von Membranproteinen Verbunden mit Krankheit, und der University of Toronto öffnen Fellowship. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der Canadian Institutes of Health Research (MOP-67210) bis WAH unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
| 0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
| Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
| 96-well quartz plate | Hellma | |||
| VWR Digital Heatblock | VWR | |||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).
- Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).
- Iyer, R., Williams, C., Miller, C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).
- Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. 生物化学. 13, 662-670 (1974).
- Snider, J. Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase. J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).
- Kashiwagi, K. Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).
- Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure. 8, 1-6 (2000).
- Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D., Curtiss, R., Neidhardt, F. C. . Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).
- Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase. Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).
- Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).
- Merrell, D. S., Camilli, A. The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).
- Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l., Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase. EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).
