Un ensayo para medir la actividad de Escherichia coli Inducible lisina Decarboxyase
Summary
La actividad de la descarboxilasa inducible lisina es controlada por la reacción del sustrato L-lisina y el producto cadaverina con 2,4,6-trinitrobenzensulfonic ácido para formar aductos que tienen una solubilidad diferencial en tolueno.
Abstract
Escherichia coli es una bacteria entérica que es capaz de crecer en un amplio rango de valores de pH (pH 5-9) 1 e, increíblemente, es capaz de sobrevivir ácido extremas tensiones incluyendo el paso por el estómago de mamíferos en donde el pH puede caer tan bajo como pH 1 – 2 2. Para permitir una gama tan amplia de la supervivencia de pH ácido, E. coli posee cuatro descarboxilasas diferentes inducible descarboxilación de aminoácidos que los ácidos amino sustrato en forma de protones dependiente de lo que aumenta el pH interno. El descarboxilasas incluyen el ácido glutámico descarboxilasas Gada y GadB 3, la arginina descarboxilasa Adia 4, la lisina descarboxilasa LdcI 5, 6 y la ornitina decarboxilasa SPEF 7. Todas estas enzimas utilizan piridoxal-5'-fosfato como un co-factor 8 y funcionan en conjunto con la membrana interna de productos sustrato antiporters que eliminar los productos de descarboxilación al medio externo a cambio de sustrato fresco 2. En el caso de LdcI, el antiporter lisina cadaverina se llama Cadb. Recientemente, se determinó la estructura cristalina de rayos X de LdcI a 2,0 Å, y descubrimos una novela pequeña molécula unida a la guanosina LdcI respuesta regulador estricto 5'-difosfato, 3'-difosfato (ppGpp) 14. La respuesta estrictas ocurre cuando las células en crecimiento exponencial experiencia de la privación de nutrientes o una de una serie de otros factores de estrés 9. Como resultado, las células producen ppGpp que conduce a una cascada de señalización que culmina en el cambio de un crecimiento exponencial a fase estacionaria del crecimiento 10. Hemos demostrado que ppGpp es un inhibidor específico de LdcI 14. A continuación se describe el ensayo de lisina descarboxilasa, una modificación del ensayo desarrollado por Phan et al. 11, que hemos utilizado para determinar la actividad de LdcI y el efecto de pppGpp / ppGpp en esa actividad. La reacción de descarboxilación LdcI elimina el grupo α-carboxilo de la L-lisina y produce dióxido de carbono y la cadaverina poliamina (1,5-diaminopentano) 5. L-lisina y la cadaverina puede reaccionar con el ácido 2,4,6-trinitrobenzensulfonic (TNBS) a un pH elevado para generar N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverina) y N, N-bistrinitrophenyllysine (TNP-lisina), respectivamente 11. El TNP-cadaverina se puede separar de la TNP-lisina como el primero es soluble en disolventes orgánicos como el tolueno y el segundo no lo es (ver Figura 1). El rango lineal del ensayo fue determinado empíricamente por medio purificada cadaverina.
Protocol
Discussion
En el ensayo de lisina descarboxilasa, TNBS se hace reaccionar con las aminas primarias de L-lisina y la cadaverina para formar TNP-lisina y TNP-cadaverina aductos (Figura 1). Debido a la presencia del grupo ácido carboxílico de TNP-lisina, este aducto permanece soluble en agua, mientras que el TNP-cadaverina, que carecen del grupo ácido carboxílico, es capaz de partición en tolueno 11. Este tipo de ensayo puede ser utilizado más ampliamente en otros tipos de aminoácidos que la pérdida de un grupo ác…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Dr. Michael Cashel (National Institutes of Health, Bethesda, MA, EE.UU.) para el envío de cepas bacterianas, plásmidos y protocolos necesarios. Agradecemos al Dr. John Glover (Departamento de Bioquímica de la Universidad de Toronto) para el uso del lector de placas SpecraMax. Reino Unido es el destinatario de un Nacional de Ciencias e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) Becas de Postgrado, de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud del Programa Estratégico de Formación en la biología estructural de proteínas de membrana ligados a la enfermedad, y de la Universidad de Toronto comunión abierta. Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (MOP-67210) a WAH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
| 0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
| Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
| 96-well quartz plate | Hellma | |||
| VWR Digital Heatblock | VWR | |||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
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