Summary

In utero électroporation suivie par la culture neuronale primaire pour étudier la fonction des gènes dans un sous-ensemble des neurones corticaux

Published: October 08, 2010
doi:

Summary

Électroporation in utero est une méthode utile pour transfecter des cellules progénitrices neuronales in vivo. Selon le placement des électrodes et la période de développement de l'électroporation, certains sous-ensembles de cellules corticales peuvent être ciblées. Cellules ciblées peuvent ensuite être analysées in vivo ou in vitro des effets de l'altération génétique.

Abstract

Dans l'étude in vitro de cultures primaires de neurones permet une analyse quantitative de la croissance des neurites. Afin d'étudier comment des altérations génétiques affectent excroissance processus neuronaux, shRNA ou des constructions d'ADNc peuvent être introduits dans les neurones primaires via la transfection chimiques ou transduction virale. Cependant, avec des cellules primaires du cortex, une piscine hétérogène de types de cellules (neurones glutamatergiques de différentes couches, les neurones inhibiteurs, les cellules gliales) sont transfectées en utilisant ces méthodes. L'utilisation d'électroporation in utero à introduire les constructions d'ADN dans le cortex des rongeurs embryonnaire permet de certains sous-ensembles de cellules d'être la cible: alors que l'électroporation de début des cibles du cortex embryonnaire couches profondes du cortex, électroporation à la fin de timepoints embryonnaire cibles couches les plus superficielles. En outre, le placement des électrodes différentielles travers les têtes des résultats individuels des embryons dans le ciblage des régions dorso-ventrale par rapport médial-latéral du cortex. Après électroporation, les cellules transfectées peuvent être disséquées, dissocié, et plaqué in vitro pour l'analyse quantitative de la croissance des neurites. Ici, nous fournissons une méthode, étape par étape pour mesurer quantitativement excroissance processus neuronaux sous-ensembles de cellules corticales.

Le protocole de base pour électroporation in utero a été décrite en détail dans deux articles JoVE d'autres du laboratoire Kriegstein 1, 2. Nous allons donner un aperçu de notre protocole d'électroporation in utero, en se concentrant sur ​​les détails les plus importants, suivie par une description de notre protocole qui s'applique électroporation in utero à l'étude de la fonction des gènes dans le processus d'excroissance neuronale.

Protocol

Le protocole de base pour électroporation in utero a été décrite en détail dans un autre article JoVE du laboratoire Kriegstein 1, 2. Cette technique a été initialement décrite dans les 3 Osumi laboratoire et notre protocole est basé sur celui développé dans le laboratoire LoTurco 4. Nous allons donner un aperçu du protocole notre pour électroporation in utero d'embryons de rats, en se concentrant sur ​​les détails les plus import…

Discussion

Dans l'étude in vitro de cultures primaires de neurones permettent des analyses quantitatives des neurites. Afin d'étudier comment des altérations génétiques affectent excroissance neuronale processus, des constructions ou des shRNA misexpression peuvent être introduits dans les neurones primaires via la transfection chimiques ou transduction virale. Cependant, avec des cellules primaires du cortex, une piscine hétérogène de types de cellules (neurones glutamatergiques de différentes couches, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Joseph LoTurco et Dennis Selkoe pour des discussions utiles sur cette technique. Les auteurs remercient les donateurs de la Fondation d'aide de la Santé, pour le soutien de cette recherche.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Cortical Neuron Preparation        
Dissection Media:        
10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free)   Gibco 14185-052  
10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 )   Gibco 14065-056  
1M HEPES pH 7.4   Gibco 15630-080  
Dishes and Vials:        
100 x 15 mm Petri Dishes Fisherbrand 08-757-12  
60 x 15 mm Petri Dishes   BD Falcon 351007  
15 mL conical vial   Sarstedt 62-547-205  
50 mL conical vial   Sarstedt 62-554-205  
Dissection Tools:        
Scissors   Fine Science Tools 91402-12  
Standard Forceps Fine Science Tools 11000-12  
Curved Forceps   Fine Science Tools 11273-20  
Fine Forceps   Fine Science Tools 11255-20  
Vannas spring scissors   Fine Science Tools 15000-00  
Miscellaneous:        
.25% Trypsin-EDTA   Gibco 25200  
Reichert Bright-Line Hemacytometer   Hausser Scientific 1490  
Hand-Held Tally Counter   Sigma Z169021  
Plating Medium:        
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM)   Gibco 11960-051  
Fetal Bovine Serum   Sigma F4135  
Penicillin-Streptomycin   Gibco 15140  
L-glutamine   Gibco 25030  
Growth Medium:        
NEUROBASAL Medium   Gibco 21103-049  
B-27 Serum-Free Supplement   Gibco 17504-044  
GlutaMAX -I Supplement   Gibco 35050-061  
Gentamicin Reagent Solution   Gibco 15750-060  
Immunostaining:        
Fixative, Washes, and Blocking Buffer:        
Paraformaldehyde   Sigma P6148  
Phosphate Buffered Saline   Sigma P4417  
Triton X-100   Sigma T9284  
Donkey Serum   Jackson Immuno 017-000-121  
Antibodies:        
beta-III tubulin antibody   Chemicon MAB1637  
MAP2 antibody   Chemicon AB15452  
Donkey Cy3 anti-mouse   Jackson Immuno 715-166-151  
Donkey Cy2 anti-chicken   Jackson Immuno 703-226-155  
DAPI   Gibco D3571  
Slide Preparation:        
CC2 Coated Two-Chamber Slides   Lab-Tek 154852  
Fluorescent Mounting Media   KPL 71-00-16  
24 x 60 mm Micro Cover Glasses   VWR 48393-106  
Clear nail polish   Electron Microscopy Sciences 72180  
Electroporation:        
Ketamine   Henry Schein 995-2949  
Xylazine   Henry Schein 4015809TV  
buprenorphine   Henry Schein 1118217  
Picospritzer III   Parker    
BTX square wave electroporator   Fisher BTXECM830  
Tweezertrodes, 7 mm, platinum   Harvard Apparatus 450488  

References

  1. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
  2. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
  3. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
  4. Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
  5. Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
  6. Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
  7. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
  8. Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
  9. Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).

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Cite This Article
Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103, doi:10.3791/2103 (2010).

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