No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais
Summary
Na eletroporação utero é um método valioso para transfecting células progenitoras neuronal in vivo. Dependendo da colocação dos eletrodos e do ponto no tempo de desenvolvimento de eletroporação, certos subgrupos de células corticais podem ser alvo. Células-alvo podem então ser analisados in vivo ou in vitro para efeitos da alteração genética.
Abstract
Estudo in vitro de culturas primárias neuronais permite análises quantitativas de crescimento de neuritos. A fim de estudar como as alterações genéticas afetam conseqüência processo neuronal, ou construções shRNA cDNA pode ser introduzida em neurônios primários via transfecção química ou transdução viral. No entanto, com células corticais primárias, uma piscina heterogêneo de tipos de células (neurônios glutamatérgicos de diferentes camadas, os neurônios inibitórios, células da glia) são transfectadas com estes métodos. O uso da eletroporação no utero para introduzir DNA construções no córtex roedores embrionárias permite a determinados subconjuntos de células a ser alvo: enquanto eletroporação dos primeiros alvos do córtex embrionário camadas profundas do córtex, eletroporação na tarde timepoints embrionárias alvos camadas mais superficiais. Além disso, a colocação de eletrodos diferenciais entre as cabeças dos resultados individuais de embriões na segmentação de regiões dorsal-medial ventral contra-lateral do córtex. Após a eletroporação, as células transfectadas podem ser dissecados, dissociados, e banhado in vitro para a análise quantitativa do crescimento de neuritos. Aqui, nós fornecemos um método passo-a-passo para medir quantitativamente conseqüência processo neuronal em subconjuntos de células corticais.
O protocolo básico para eletroporação no útero tem sido descrito em detalhes em dois artigos JOVE outros do laboratório Kriegstein 1, 2. Nós iremos fornecer uma visão geral do nosso protocolo para a utero eletroporação, focando os detalhes mais importantes, seguido por uma descrição do nosso protocolo que se aplica em eletroporação utero ao estudo da função do gene em conseqüência processo neuronal.
Protocol
Discussion
Estudo in vitro de culturas primárias neuronais permitem análises quantitativas de crescimento de neuritos. A fim de estudar como as alterações genéticas afetam conseqüência processo neuronal, construções ou shRNA misexpression pode ser introduzida em neurônios primários via transfecção química ou transdução viral. No entanto, com células corticais primárias, uma piscina heterogêneo de tipos de células (neurônios glutamatérgicos de diferentes camadas, os neurônios inibitórios, c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Joseph Loturco e Dennis Selkoe para discussões úteis sobre esta técnica. Os autores agradecem os doadores da Fundação Americana de Assistência à Saúde, para apoio a esta pesquisa.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cortical Neuron Preparation | ||||
| Dissection Media: | ||||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | Gibco | 14185-052 | ||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | Gibco | 14065-056 | ||
| 1M HEPES pH 7.4 | Gibco | 15630-080 | ||
| Dishes and Vials: | ||||
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisherbrand | 08-757-12 | ||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351007 | ||
| 15 mL conical vial | Sarstedt | 62-547-205 | ||
| 50 mL conical vial | Sarstedt | 62-554-205 | ||
| Dissection Tools: | ||||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | ||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | ||
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | ||
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Miscellaneous: | ||||
| .25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | ||
| Hand-Held Tally Counter | Sigma | Z169021 | ||
| Plating Medium: | ||||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
| Growth Medium: | ||||
| NEUROBASAL Medium | Gibco | 21103-049 | ||
| B-27 Serum-Free Supplement | Gibco | 17504-044 | ||
| GlutaMAX -I Supplement | Gibco | 35050-061 | ||
| Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15750-060 | ||
| Immunostaining: | ||||
| Fixative, Washes, and Blocking Buffer: | ||||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
| Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | ||
| Antibodies: | ||||
| beta-III tubulin antibody | Chemicon | MAB1637 | ||
| MAP2 antibody | Chemicon | AB15452 | ||
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson Immuno | 715-166-151 | ||
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson Immuno | 703-226-155 | ||
| DAPI | Gibco | D3571 | ||
| Slide Preparation: | ||||
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | ||
| Fluorescent Mounting Media | KPL | 71-00-16 | ||
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | ||
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | ||
| Electroporation: | ||||
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | ||
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | ||
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | ||
| Picospritzer III | Parker | |||
| BTX square wave electroporator | Fisher | BTXECM830 | ||
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
References
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
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- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
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- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
