Isolatie van hersenen en ruggenmerg mononucleaire cellen met behulp van Percoll Verlopen
Summary
Het huidige artikel beschrijft een snelle protocol om efficiënt te isoleren mononucleaire cellen van hersenen en het ruggenmerg weefsels die effectief kan worden gebruikt voor flowcytometrische analyses.
Abstract
Isolatie van immuuncellen die het centrale zenuwstelsel (CZS) tijdens infectie, trauma, auto-immuniteit of neurodegeneratie infiltreren, is het vaak nodig om hun fenotype en effector functies te definiëren. Histochemische benaderingen zijn wat belangrijk is voor de locatie van de infiltrerende cellen te bepalen en om de bijbehorende CNS pathologie analyseren. Echter, in-situ histochemie en immunofluorescentie kleuringstechnieken beperkt door het aantal antilichamen die gebruikt kunnen worden in een keer om immuun cel subtypen karakteriseren in een specifiek weefsel. Daarom, histologische benadering in combinatie met immuun-fenotypering door flowcytometrie zijn cruciaal voor het volledig karakteriseren van de samenstelling van de lokale CNS infiltratie. Dit protocol is gebaseerd op de scheiding van CNS cellulaire suspensies meer dan discontinous Percoll gradiënten. Het huidige artikel beschrijft een snelle protocol om efficiënt te isoleren mononucleaire cellen van hersenen en het ruggenmerg weefsels die effectief kan worden gebruikt voor de identificatie van verschillende immuun celpopulaties in een enkel monster door flowcytometrie.
Protocol
Discussion
Analyses van celoppervlaktemerkers in het CZS leukocyten uit normale muis ontstoken weefsels zijn gebruikt voor enkele decennia 1-3. Isolatie protocollen zijn gebaseerd op de scheiding van microglia en leukocyten door de dichtheid centrifugeren 4. Hier beschrijven we een snelle en effectieve methode voor het isoleren van CNS leukocyten met behulp van discontinue Percoll gradiënten. Na isolatie van cellen, kleuring met verschillende antilichamen, zoals-maar niet beperkt tot-CD45, CD4, CD8, CD11b, C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T naar AEC) en de Universiteit van Texas in San Antonio.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
- Percoll (Amersham)
- 10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
- RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
- 7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Flow cytometry
- Cell Staining Buffer (Biolegend)
- Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
- Hemacytometer (Fisher)
- Anti-mouse CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
- 10X Phosphate Buffered Saline, without Calcium and Magnesium (Thermo Scientific)
- Paraformaldehyde (Sigma Aldrich)
- Flow cytometry analysis performed with a LSR II (BD Biosciences)
References
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
- Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. , (2010).
- Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
- Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
