パーコール勾配を用いて脳と脊髄単核細胞の単離
Summary
現在の記事は、効率的効果的にフローサイトメトリー分析に利用することができる脳や脊髄の組織から単核細胞を分離するために迅速なプロトコルを記述します。
Abstract
感染症、外傷、自己免疫疾患または神経変性における中枢神経系（CNS）に浸潤する免疫細胞の単離は、しばしばそれらの表現型とエフェクター機能を定義する必要があります。組織化学的アプローチは、浸潤細胞の位置を決定するために、病理関連したCNSを分析するための手段です。しかし、現場組織化学および免疫蛍光染色の技法は、特定の組織に免疫細胞のサブタイプを特徴付けるために一度に使用できる抗体の数によって制限されています。したがって、フローサイトメトリーによる免疫フェノタイピングと一緒に組織学的なアプローチは、完全にローカルのCNS浸潤の組成を特徴づけるために不可欠です。このプロトコルは、不連続パーコール勾配以上のCNSの細胞懸濁液の分離に基づいています。現在の記事は、効率的効果的にフローサイトメトリーにより、単一のサンプル中の様々な免疫細胞集団の同定に利用することができる脳や脊髄の組織から単核細胞を単離するために迅速なプロトコルを記述します。
Protocol
Discussion
正常および炎症のマウス組織から中枢神経系の白血球の細胞表面マーカーの分析は、1月3日数十年にわたって利用されている。分離プロトコルは密度遠心4によるミクログリアと白血球の分離に基づいています。ここでは、不連続パーコール勾配を用いて、CNSの白血球を分離するの迅速かつ効果的な方法を説明します。細胞の単離の後、次のような – ではなく、CD45に限られた?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、全国多発性硬化症協会（TA AECへの3021 – A1 / T）とテキサス大学サンアントニオ校によってサポートされていました。
Materials
Tissue homogenization and Gradients
- Percoll (Amersham)
- 10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
- RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
- 7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Flow cytometry
- Cell Staining Buffer (Biolegend)
- Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
- Hemacytometer (Fisher)
- Anti-mouse CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
- 10X Phosphate Buffered Saline, without Calcium and Magnesium (Thermo Scientific)
- Paraformaldehyde (Sigma Aldrich)
- Flow cytometry analysis performed with a LSR II (BD Biosciences)
References
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
- Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. , (2010).
- Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
- Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
