Une préparation isolée rétinienne pour enregistrer la réponse de Lumière génétiquement marqués cellules ganglionnaires rétiniennes
Summary
Cet article fournit une description de la manière de disséquer et d'enregistrer à partir de la préparation isolée de la rétine chez la souris. En particulier, nous décrivons comment enregistrer les réponses de lumière provenant d'une population de cellules ganglionnaires marqués par fluorescence et par la suite identifier et d'analyser sa morphologie.
Abstract
Les premières étapes de la vision des vertébrés ont lieu lorsque la lumière stimule les photorécepteurs tige et le cône de la rétine 1. Cette information est ensuite séparé en ce qui sont connus comme les voies ON et OFF. Les informations sur le signal des photorécepteurs de lumière pour les cellules bipolaires (BCS), qui dépolariser en réponse à des augmentations (Sur CB) ou diminue (Off BC) de l'intensité lumineuse. Cette ségrégation de l'information lumineuse est maintenue au niveau des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), qui ont des dendrites stratifier soit dans le sublamina Off de la couche interne plexiforme (IPL), où ils reçoivent l'entrée directe excitateurs de Off BCS, ou de la stratification dans les Sur l'sublamina de l'IPL, où ils reçoivent l'entrée directe à partir excitateurs Le BCS. Cette ségrégation des informations concernant les augmentations ou diminutions d'éclairement (On et Off voies) est conservée et signalés au cerveau en parallèle.
Le CGR sont les cellules de sortie de la rétine, et sont donc une cellule important d'étudier afin de comprendre comment l'information est signalée à la lumière des noyaux visuelle dans le cerveau. Les progrès de la génétique de la souris sur les dernières décennies ont abouti à une variété de lignées de souris fluorescentes journaliste, où des populations spécifiques CJR sont étiquetés avec une protéine fluorescente pour permettre l'identification des sous-types du CJR 2 3 4 et spécifiques de ciblage pour l'enregistrement électrophysiologique. Ici, nous présentons une méthode pour l'enregistrement des réponses de lumière à partir des cellules ganglionnaires marqués par fluorescence dans une intacte, la préparation rétine isolée. Cette préparation permet de rétine isolée à partir d'enregistrements CGR où la tonnelle dendritiques est intact et les entrées dans la tonnelle dendritiques CJR ensemble sont préservés. Cette méthode est applicable à travers une variété de sous-types de cellules ganglionnaires et se prête à une grande variété d'organismes unicellulaires techniques physiologiques.
Protocol
Discussion
Cette technique est applicable à tous les enregistrements de cellules ganglionnaires rétiniennes à partir d'une rétine isolée. Bien que, dans la lignée de souris utilisée ci-dessus intrinsèquement photosensibles, exprimant la mélanopsine CGR sont étiquetés avec EGFP 2, 5, ce protocole est facilement transférable à d'autres lignes marquées par fluorescence CJR ou peuvent être généralisés à enregistrer à partir de CGR choisis au hasard ainsi. Cette technique est particulièrement pr?…
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Nous tenons à remercier Darwin Accrochez pour son aide technique.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ames’ Medium | Sigma | A1420 | ||
| Collagenase | Whorthington Biochemical | LS005273 | ||
| Hyaluronidase | Whorthington Biochemical | LS002592 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | ||
| AlexaFluor 594 Hydrazyde | Invitrogen | A10442 | ||
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP1120 | ||
| Electrodes | Sutter Instruments | BF120-69-10 | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | ||
| Ophthalmologic Scissor | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Streptavidin 594 | Invitrogen | S32356 | ||
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-001 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
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