Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord
Summary
Dieser Artikel enthält eine Beschreibung, wie zu sezieren und Datensatz aus der isolierten Netzhaut Vorbereitung in der Maus. Insbesondere beschreiben wir, wie Licht von Antworten eines fluoreszenzmarkierten Ganglienzelle Bevölkerung aufzunehmen und anschließend zu identifizieren und zu analysieren, ihre Morphologie.
Abstract
Die ersten Schritte in Wirbeltieren Vision statt, wenn das Licht regt den lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen der Netzhaut 1. Diese Information wird dann in das, was als die ON und OFF Wege bekannt getrennt. Die Photorezeptoren Signallicht Informationen zu den bipolaren Zellen (BCS), die als Reaktion auf Erhöhungen (über BCS) oder verringert (Off BCs) in der Lichtintensität depolarisieren. Diese Trennung von Licht Informationen auf der Ebene des retinalen Ganglienzellen (RGC), die Dendriten Stratifizierung entweder im Off sublamina der inneren plexiformen Schicht (IPL), wo sie erhalten direkten exzitatorischen Input von Off BCs haben behauptet, oder Stratifizierung in der On sublamina der IPL, wo sie erhalten direkten exzitatorischen Input von über BCS. Diese Trennung von Informationen über Erhöhungen oder Verminderungen Beleuchtung (die Ein-und Ausschalten Wege) konserviert ist und signalisiert dem Gehirn in parallel.
Die RGCs sind der Ausgang Zellen der Netzhaut, und sind somit eine wichtige Zelle in Ordnung Studie zu verstehen, wie Licht Informationen zu visuellen Kerne im Gehirn signalisiert. Advances in Mausgenetik in den letzten Jahrzehnten wurden in einer Vielzahl von fluoreszierenden Reporter-Maus Linien, in denen spezifische RGC Populationen mit einem fluoreszierenden Protein markiert sind, für die Identifizierung von RGC-Subtypen 2 3 4 und Targeting für die elektrophysiologische Ableitung ermöglichen geführt. Hier präsentieren wir eine Methode zur Aufzeichnung von Licht Antworten von fluoreszenzmarkierten Ganglienzellen in einer intakten, isolierten retinalen Vorbereitung. Diese isolierten retinalen Vorbereitung ermöglicht Aufnahmen aus RGCs wo die dendritischen Dorn ist intakt und die Eingänge über die gesamte RGC dendritischen Dorn bleiben erhalten. Dieses Verfahren ist anwendbar für eine Vielzahl von Ganglienzellen Subtypen und ist offen für eine Vielzahl von Single-Cell-physiologischen Methoden.
Protocol
Discussion
Diese Technik ist für alle retinalen Ganglienzellen Aufnahmen aus einer isolierten Netzhaut. Obwohl in der Mauslinie oben verwendeten intrinsisch lichtempfindlichen, Melanopsin-exprimierenden RGCs mit EGFP 2, 5 gekennzeichnet sind, ist dieses Protokoll ohne weiteres auf andere fluoreszenzmarkierte RGC Linien oder verallgemeinert werden können, um aus zufällig ausgewählten RGCs sowie Rekord. Diese Technik ist besonders wertvoll, weil die dendritischen Dorn jedes RGC und ihre jeweiligen Eingangs-Neuronen li…
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133 unterstützt. Wir bedanken uns bei Darwin Hang für seine technische Unterstützung.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ames’ Medium | Sigma | A1420 | ||
| Collagenase | Whorthington Biochemical | LS005273 | ||
| Hyaluronidase | Whorthington Biochemical | LS002592 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | ||
| AlexaFluor 594 Hydrazyde | Invitrogen | A10442 | ||
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP1120 | ||
| Electrodes | Sutter Instruments | BF120-69-10 | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | ||
| Ophthalmologic Scissor | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Streptavidin 594 | Invitrogen | S32356 | ||
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-001 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
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