المؤتلف إنتاج فيروسات الرجعية والعدوى من خلايا B
Summary
نظام فعال لهيكل وتحليل وظيفة الجين في<em> خارج الحي</emيوصف> ثقافة الخلايا الليمفاوية B – الطحال. هذا الأسلوب يستفيد من المؤتلف إنتاج فيروسات في حر مساعد ، ecotrophic تغليف خط الخلية. مستقرة ، والموروثة التعبير عن الجينات داخل الخلايا الليمفاوية من الفائدة الأساسي هو تحقيق تؤدي إلى توليد أجسام مضادة على سطح الخلايا البائية تمر فئة التوحد التبديل.
Abstract
التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا في الخلايا حقيقية النواة هي قوية نهج الجينية العكسية التي يتم التعبير عن الجينات في المصالح الخاضعة لسيطرة نظام تعبير مغايرة لتسهيل تحليل النمط الظاهري الناتج. ويمكن استخدام هذه الطريقة للتعبير عن الجينات التي لا توجد عادة في الكائن الحي ، للتعبير عن شكل متحولة من منتج الجين ، أو المبالغة في التعبير عن الشكل السائد السلبية للمنتج الجين. انها مفيدة بشكل خاص في دراسة النظام hematopoetic حيث التنظيم الترانسكربتي آلية رقابية كبرى في تطوير وتمايز الخلايا باء (1) ، واستعرض في 2-4.
الماوس الوراثة هو أداة قوية لدراسة الجينات البشرية والأمراض. تحليل مقارن للفأرة والجينوم البشري يكشف حفظ تصاحب جيني في أكثر من 90 ٪ من الجينوم 5 ، وأيضا الكثير من التكنولوجيا المستخدمة في نماذج الماوس ينطبق على دراسة الجينات البشرية ، على سبيل المثال ، والاضطرابات الجينية واستبدال أليلية 6 ومع ذلك ، فإن إنشاء ماوس المعدلة وراثيا يتطلب قدرا كبيرا من الموارد الطبيعة على حد سواء المالية والتقنية. وقد بدأت عدة مشاريع لتجميع مكتبات ضرب سلالات الماوس (KOMP ، EUCOMM ، NorCOMM) أو الطفرات المستحثة سلالات (بتبريد) ، والتي تتطلب جهودا واسعة النطاق والتعاون 7. ولذلك ، فمن المستحسن أن أول دراسة على النمط الظاهري من الجين المطلوب في نموذج خلية ثقافة الخلايا الأولية قبل التقدم إلى نموذج الفأر.
فيروسات الحمض النووي DNA يدمج المضيفة ، ويفضل أن يكون داخل أو بالقرب من وحدة النسخ أو الجزر CPG ، مما أدى إلى مستقر وراثية التعبير عن الجينات وتعبئتها من الفائدة بينما تجنب إسكات الترانسكربتي 8 9. وكتب بعد ذلك الجينات تحت سيطرة أحد المروجين فيروسات كفاءة عالية ، مما أدى إلى كفاءة عالية من النسخ وإنتاج البروتين. ولذلك ، يمكن استخدام التعبير فيروسات مع الخلايا التي يصعب transfect ، شريطة أن الخلايا في حالة نشطة خلال الانقسام. لأن ترد الجينات الهيكلية للفيروس داخل العبوة خط الخلية ، وناقلات التعبير المستخدم لاستنساخ الجينات في المصالح لا تحتوي على جينات الفيروس الهيكلية ، وكلاهما يلغي احتمال revertants الفيروسية ويزيد من سلامة العمل مع supernatants الفيروسية كما يتم إنتاج أي virions المعدية 10.
هنا نقدم مشروع بروتوكول لإنتاج فيروسات المؤتلف والعدوى اللاحقة من الخلايا باء الطحال. بعد العزلة ، ويتم تحفيز الخلايا المستزرعة الطحال مع ث lymphokines المشتقة ومعاداة CD40 ، والذي يدفع إلى موجة عارمة من انتشار الخلايا والتمايز ب 11. هذا البروتوكول هو مثالي لدراسة الأحداث التي وقعت في وقت متأخر من تطوير خلايا B وتمايز ، حيث يتم عزل الخلايا البائية من الأحداث التالية الطحال hematopoetic الأولي ولكن قبل التحفيز مستضدي للحث على تمايز بلازماوي.
Protocol
Discussion
تنبيغ فيروسات من خلايا الطحال B كما هو موضح هنا ، وكما هو مبين في الشكل رقم 1 هو نهج الوراثية يمكن أن يكون مفيدا في دراسة الخلايا الليمفاوية B – لأن يتم التحكم في العديد من الفعاليات التنموية في lymphopoesis عن طريق التنظيم الترانسكربتي 1 و 2. في مراحل لاحقة من نض…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
معتمد من قبل البرنامج CK الدراسات العليا في جامعة كولومبيا. UB هو زميل اللوكيميا وسرطان الغدد الليمفاوية جمعية الأمريكية ، وحاصل على جائزة الباحث جديد من مؤسسة أبحاث اللوكيميا ومعتمد من قبل جامعة كلية كولومبيا الجديد البدء الأموال.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| RPMI | Invitrogen/Gibco | 22400 | ||
| PBS | Invitrogen/Gibco | 20012 | ||
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | ||
| CD43 beads | Miltenyi | |||
| B Cell Complete Media | Various components | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol | |
| IL-4 | ||||
| Anti-CD40 | BD Pharmigen | 553787 | ||
| polybrene | Sigma Aldrich | 107689 | ||
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma Aldrich | C6628 | Used at 100mM | |
| Phoenix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | ||
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | ||
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Pharmigen | A85-1 |
References
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. . Introduction to Genetic Analysis. , (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).
