Summary

Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen

Published: February 18, 2011
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Summary

Ein effizientes System der Struktur-und Funktionsanalyse eines Gens in einer<em> Ex vivo</em> Kultur der Milz B-Lymphozyten beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile der rekombinanten retroviralen Produktion in ein Helfer frei, ecotrophic Verpackungs-Zelllinie. Stabile, vererbbare Expression eines Gens von Interesse innerhalb des primären Lymphozyten erreicht, was zu Generation Oberfläche Antikörper auf B-Zellen durchlaufen Klasse wechseln Rekombination.

Abstract

Die transgenen Expression von Genen in eukaryotischen Zellen ist ein leistungsfähiges reverse genetische Ansatz, bei dem ein Gen von Interesse unter der Kontrolle eines heterologen Expressionssystem exprimiert wird, um die Analyse der resultierenden Phänotyp zu erleichtern. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um ein Gen, das normalerweise nicht in den Organismus gefunden auszudrücken, um eine mutierte Form des Gens Produkt zum Ausdruck bringen, oder zu überexprimieren eine dominant-negative Form des Genprodukts werden. Es ist besonders nützlich in der Studie des hämatopoetischen Systems, wo Transkriptionsregulation ist ein wichtiger Kontrollmechanismus in der Entwicklung und Differenzierung von B-Zellen 1, in 2-4 überprüft.

Mausgenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Erforschung der menschlichen Gene und Krankheiten. Eine vergleichende Analyse der Maus und menschlichen Genoms offenbart Erhaltung der Syntenie in mehr als 90% des Genoms 5. Außerdem ist ein Großteil der Technologie in Maus-Modellen verwendet werden für das Studium der menschlichen Gene, zum Beispiel Gendisruptionen und allelische Austausch 6 . Allerdings erfordert die Schaffung einer transgenen Maus ein hohes Maß an Ressourcen sowohl eine finanzielle und technische Natur. Mehrere Projekte wurden begonnen, um Bibliotheken von Knock-out-Maus-Stämme (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) oder Mutagenese induzierte Belastungen (RIKEN), die großen Anstrengungen und Zusammenarbeit 7 erfordern kompilieren. Daher ist es wünschenswert, erste Studie der Phänotyp eines gewünschten Gens in einer Zellkultur-Modell von primären Zellen vor fortschreitend bis zu einem Mausmodell.

Retrovirale DNA integriert in die Wirts-DNA, vorzugsweise innerhalb oder in der Nähe Transkription Einheiten oder CpG-Inseln, die sich in stabilen und vererbbar Ausdruck des verpackten Gen von Interesse unter Vermeidung transkriptionellen Silencing 8 9. Die Gene werden dann unter der Kontrolle von einem hohen Wirkungsgrad retroviralen Promotor transkribiert, was zu einer hohen Effizienz der Transkription und Protein-Produktion. Daher kann retroviralen Expressionsvektor mit Zellen, die schwer zu transfizieren sind, verwendet werden, sofern die Zellen in einen aktiven Zustand während der Mitose. Da die strukturellen Gene des Virus innerhalb der Verpackungs-Zelllinie enthalten sind, enthalten die Expressionsvektoren verwendet werden, um das Gen von Interesse Klon keine strukturellen Gene des Virus, das sowohl die Möglichkeit der viralen Revertanten beseitigt und erhöht die Sicherheit bei der Arbeit mit viralen Überständen da keine infektiösen Virionen sind 10 hergestellt.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die rekombinante retrovirale Produktion und nachfolgende Infektion von Milz-B-Zellen. Nach der Isolierung werden die kultivierten Milzzellen mit Th abgeleitet Lymphokine und anti-CD40, die einen Ausbruch von B-Zell-Proliferation und Differenzierung 11 induziert stimuliert. Dieses Protokoll ist ideal für die Untersuchung der Ereignisse am späten B-Zell-Entwicklung und Differenzierung, wie B-Zellen aus der Milz nach der ersten hämatopoetischen Ereignisse, sondern vor antigenen Stimulation plasmazelluläre Differenzierung induzieren isoliert sind.

Protocol

1. Milz B-Lymphozyten-Isolierung und Stimulation Ernten Sie die Milz von AID-defizienten Mäusen 12 zwischen 2-3 Monate alt. Die Isolierung der Milz ist in sterilen Bedingungen durchgeführt und die Organe sind vorübergehend in kaltem Phosphatpuffer (PBS) mit 15% fötalem Rinderserum (FBS) gehalten. Die Milz wird dann auf eine sterile Gewebekultur Haube übertragen und homogenisiert in 5 ml PBS mit 2,5% FBS. Übertragen Sie die Homogenat in ein 15 ml Falcon-Röhrchen. Centrifug…

Discussion

Retrovirale Transduktion von Milz-B-Zellen, wie hier beschrieben und wie abgebildet in Abbildung 1 ist eine genetische Ansatz, die nützlich bei der Untersuchung der B-Lymphozyten ist, weil viele der Entwicklungs-Veranstaltungen in lymphopoesis durch Regulation der Transkription 1, 2 gesteuert werden. In den späteren Stadien der B-Zell-Reifung, Triggerung über CD40L ist essentiell für die Induktion der B-Zell-Wachstum, Eintritt in den Zellzyklus und Proliferation 11, 20. Wie in …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CK wird von der Columbia University Graduate-Programm unterstützt. UB ist Fellow der Leukemia and Lymphoma Society of America, die Empfänger von New Investigator Award der Leukämie Research Foundation und wird von der Columbia University New Faculty Anschubfinanzierung unterstützt.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
FCS   Atlanta Biologicals S11550  
RPMI   Invitrogen/Gibco 22400  
PBS   Invitrogen/Gibco 20012  
Red Blood Cell (RBC) lysis buffer   Sigma Aldrich R7757  
CD43 beads   Miltenyi    
B Cell Complete Media   Various components Various Components RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol
IL-4        
Anti-CD40   BD Pharmigen 553787  
polybrene   Sigma Aldrich 107689 
  
Chloroquine diphosphate salt   Sigma Aldrich C6628 Used at 100mM
Phoenix Eco cells (Murine)   Orbigen RVC-10002  
PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220)   eBioscience 15-0452-81  
PE-α-mouse-IgG1   BD Pharmigen A85-1  

References

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Cite This Article
Keim, C., Grinstein, V., Basu, U. Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells. J. Vis. Exp. (48), e2371, doi:10.3791/2371 (2011).

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