בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד
Summary
פרוטוקול זה מתאר הליך ללמוד את הנשמה של המיטוכונדריה מבודד שרירי השלד. שיטה זו הותאמה מ Scorrano<em> Et al.</em> (2007). ההליך בידוד המיטוכונדריה דורשת כ 2 שעות. הנשימה המיטוכונדריאלי ניתן להשלים תוך שעה בערך 1.
Abstract
המיטוכונדריה הם אברונים שליטה על החיים והמוות של התא. הם משתתפים תגובות מטבוליות מפתח, לסנתז ביותר של ה-ATP, ולהסדיר מספר איתות מפלי 2,3. חוקרים בעבר ובהווה יש לבודד מרקמות המיטוכונדריה חולדות ועכברים כגון מוח, כבד, לב 4,5. בשנים האחרונות, חוקרים רבים התמקדו לומד לתפקד המיטוכונדריה של שרירי השלד.
כאן אנו מתארים שיטה השתמשנו בהצלחה הבידוד של המיטוכונדריה מן שרירי השלד 6. ההליך שלנו דורש שכל מאגרים ו ריאגנטים עשויים טריים צורך כ 250-500 מ"ג של שרירי השלד. למדנו המיטוכונדריה מבודד הגסטרוקנמיוס חולדה ועכבר הסרעפת, ואת שרירי extraocular חולדה. ריכוז חלבון מיטוכונדריאלי נמדדת עם assay ברדפורד. חשוב דגימות המיטוכונדריה להישמר קרים כקרח במהלך ההכנה כי מחקרים פונקציונלי להתבצע בתוך זמן קצר יחסית (~ 1 שעות). הנשימה מיטוכונדריאלי נמדד polarography עם אלקטרודה מסוג קלארק (מערכת Oxygraph) בשעה 37 ° C 7. כיול אלקטרודת חמצן הוא צעד מפתח פרוטוקול זה והיא חייבת להתבצע מדי יום. המיטוכונדריה מבודד (150 מיקרוגרם) מתווספים 0.5 מ"ל של חיץ ניסיוני (EB). מדינת 2 הנשימה מתחיל עם תוספת של גלוטמט (5mm) ו Malate (2.5 מ"מ). ואז, diphosphate אדנוזין (ADP) (150 מיקרומטר) מתווסף להתחיל המדינה 3. Oligomycin (1 מיקרומטר), חוסם synthase ATPase, משמש אומדן המדינה 4. לבסוף, קרבוניל ציאניד p-[trifluoromethoxy]-פניל-hydrazone (FCCP, 0.2 מיקרומטר) מתווסף measurestate 5, או זוגיים הנשימה 6. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR), היחס של המדינה 3 למצב 4, מחושב לאחר כל ניסוי. RCR ≥ 4 נחשב כהוכחה הכנה המיטוכונדריה קיימא.
לסיכום, אנו מציגים שיטה הבידוד של המיטוכונדריה קיימא של שרירי השלד כי ניתן להשתמש ביוכימית (למשל, פעילות האנזים, immunodetection, proteomics) מחקרים תפקודית (נשימה המיטוכונדריה).
Protocol
Discussion
אנו מציגים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה קיימא של שרירי השלד. אם התשואה היא בעיה, פרוטוקול ניתן לשנות על ידי דוגרים על שריר בודד 5 מ"ל של טריפסין EDTA/0.01% PBS/10mM במשך 30 דקות בקרח. כדי להבטיח עיכול שרירים להשלים עם טריפסין, השריר צריך להיות טחון לגמרי. לאחר דגירה של 30 דקות, ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מן העין לאומי (R01 EY12998) כדי FH אנדרדה.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local gas company | |||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma | A2754 | ||
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | ||
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | ||
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | |||
| Compressed nitrogen | Local gas company | |||
| D-mannitol | Sigma | M9647 | ||
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | ||
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma | A8806 | ||
| Glutamic acid | Sigma | G5889 | ||
| HEPES sodium salt | Sigma | H7006 | ||
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | |||
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | ||
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan | 300-500g | ||
| Malic acid | Sigma | M9138 | ||
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | ||
| Oxygraph | Hansatech | |||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | |||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | ||
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | ||
| Potassium phosphate | Sigma | P8416 | ||
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher | 08-414-14A | ||
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | ||
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | |||
| Sucrose | Sigma | S5016 |
References
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, S96-S102 (2004).
- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
- Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
