فصل واحدة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي ، والحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ، والحمض النووي الريبي من جالية الفيروسية البيئة باستخدام الكروماتوغرافيا هيدروكسيباتيت
Summary
نحن تصف وسيلة فعالة لفصل واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي ، والحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل وجزيئات الحمض النووي الريبي الفيروسي من المجتمعات البيئية. الأحماض النووية هي مجزأة باستخدام اللوني هيدروكسيباتيت مع زيادة تركيزات الفوسفات التي تحتوي على مخازن. هذا الأسلوب يسمح للعزل جميع أنواع الحمض النووي الفيروسي من العينات البيئية.
Abstract
الفيروسات والبكتيريا وخاصة (phages) ، هي الأكثر عددا الكيانات البيولوجية على 1،2 الأرض. فيروسات تعدل الخلية المضيفة وفرة وتنوع ، والمساهمة في تدوير المغذيات ، وتغيير النمط الظاهري الخلية المضيفة ، والتأثير في تطور الخلية المضيفة والمجتمعات على حد سواء عن طريق نقل الفيروس من الجينات الوحشي 3. وقد أبرزت دراسات عديدة للتنوع مذهل الوراثية للفيروسات وإمكاناتها الفنية في مجموعة متنوعة من البيئات الطبيعية.
وقد استخدمت تقنيات Metagenomic لدراسة التنوع التصنيفي والإمكانات الفنية للتجمعات الفيروسية المعقدة التي تحتوي على احد الاعضاء الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (ssDNA) ، الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (dsDNA) والتراكيب الوراثية RNA 4-9. البروتوكولات الحالية بناء مكتبة تستخدم لدراسة الحمض النووي التي تحتوي على الحمض النووي الريبي البيئية أو التي تحتوي على الفيروسات تتطلب علاجا nuclease الأولية من أجل إزالة القوالب nontargeted 10. ومع ذلك ، فهم شامل لتكملة الجين الجماعية للمجتمع والتنوع الفيروس الفيروس يتطلب معرفة جميع الأعضاء بغض النظر عن تركيبة الجينوم. تجزيء من المنقى فرعية الحمض النووي يوفر آلية فعالة يمكن من خلالها دراسة تجمعات الفيروسية دون التضحية مجموعة فرعية من توقيع المجتمع الجينية.
واستخدمت هيدروكسيباتيت ، شكل بلوري من فوسفات الكالسيوم ، في فصل الأحماض النووية ، فضلا عن البروتينات والميكروبات ، ومنذ 11 من 1960s. من خلال استغلال التفاعل بين المسؤول كا المشحون إيجابيا 2 + الأيونات من هيدروكسيباتيت والعمود الفقري الفوسفات سالبة الشحنة من الأنواع الفرعية الحمض النووي ، فمن المحتمل أن كل سلالة تفضيلي أزل الحمض النووي مستقلة عن الآخرين. نحن العاملين في الآونة الأخيرة لهذه الاستراتيجية في الجينوم يجزئ مستقل عن ssDNA ، dsDNA والفيروسات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي في إعداد تسلسل الحمض النووي 12. هنا ، فإننا نقدم وسيلة للتجزيء والتعافي من الأحماض ssDNA ، والحمض النووي الريبي النووي dsDNA الفيروسية من تجمعات مختلطة الفيروسية باستخدام chromotography هيدروكسيباتيت.
Protocol
Discussion
منهجية اللوني هيدروكسيباتيت المقدمة هنا هي أداة فعالة للغاية وقوية للتجزئة من الأحماض النووية من تجمعات مختلطة الفيروسية ، عندما يكون الهدف هو دراسة التركيب مجموع الحمض النووي للمجتمع. عموما ، سوف ssDNA ، RNA وdsDNA أزل من العمود تركيزات الفوسفات العازلة بو أكبر من م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل مكتب العلوم (ديسمبر) ، وزارة الطاقة الأميركية ، أي الاتفاق التعاوني. دي FC02 – 02ER63453 ، المؤسسة الوطنية للعلوم في تسلسل الجينوم الميكروبي برنامج (أرقام 0626826 و 0731916 الجائزة). نشكر جون زجاج لخبرته الفنية والمشورة وK. Wommack اريك لمساعدته في جمع العينات البيئية.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Catalogue Number |
|---|---|---|---|
| Econo-Column | Bio-Rad | 737-0717 | 0.7cm ID package/2 |
| Hydroxyapatite | Bio-Rad | 130-0520 | DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td> |
| Sodium Phosphate, Monobasic | VWR | VW1497-01 | Monohydrate, Crystal 500g |
| Sodium Phosphate, Dibasic | VWR | VW1496-01 | Anhydrous, Powder 500g |
| DEPC-treated Water | Invitrogen | AM9922 | 1L |
| 10% SDS Solution | Invitrogen | 24730-020 | UltraPure, 1L |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9262 | pH 8.0, 1L |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| 2ml serological pippette | VWR | 89130-884 | Polystyrene, Sterile |
| BD Falcon Centrifuge Tubes | VWR | 21008-936 | 15ml, Sterile |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v) | Invitrogen | 15593-031 | UltraPure, 100ml |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Device | Millipore | UFC803024 | Ultracel-30 membrane |
| 20X TE Buffer, Rnase free | Invitrogen | T11493 | 100ml |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15mg/ml |
References
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The Unseen Majority. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).
- Hendrix, R. W. Bacteriophages: evolution of the majority. Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).
- Weinbauer, M. G. Bacteriophages: Evolution of the Majority. FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).
- Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes. Nature. 455, 830-830 (2008).
- McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression. PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).
- Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples. PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).
- Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. RNA Viruses in the Sea. FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).
- Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics. J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).
- Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics. J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).
- Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities. Science. 312, 1795-1795 (2006).
- Bernardi, G. Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite. Nature. 209, 779-779 (1965).
- Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages. Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).
- Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).
