La separación de una sola hebra de ADN, el ADN de doble cadena y el ARN de una comunidad ambiental viral mediante cromatografía de hidroxiapatita
Summary
Se describe un método eficiente para separar ADN de cadena sencilla, doble cadena de ADN y las moléculas de ARN viral de las comunidades del medio ambiente. Los ácidos nucleicos son fraccionados utilizando cromatografía de hidroxiapatita con una creciente concentración de fosfato que contienen buffers. Este método permite el aislamiento de todos los tipos de ácido nucleico viral de las muestras ambientales.
Abstract
Los virus, particularmente los bacteriófagos (fagos), son las entidades biológicas más numerosas en 1,2 la Tierra. Los virus modulan la abundancia de la célula huésped y la diversidad, contribuir a los ciclos de los nutrientes, alterar anfitrión fenotipo de las células, y la influencia de la evolución de la célula huésped y de las comunidades viral a través de la transferencia lateral de genes 3. Numerosos estudios han puesto de relieve la asombrosa diversidad genética de los virus y su potencial funcional en una variedad de ambientes naturales.
Técnicas de metagenómica se han utilizado para estudiar la diversidad taxonómica y el potencial funcional de los complejos conjuntos viral cuyos miembros contienen ADN de cadena sencilla (ssDNA), el ADN de doble cadena (dsDNA) y los genotipos de ARN 4-9. Los protocolos actuales de construcción de la biblioteca para estudiar el medio ambiente que contienen ADN o ARN que contienen los virus requieren un tratamiento inicial de la nucleasa con el fin de quitar las plantillas no focalizados a 10. Sin embargo, una comprensión global de la dotación genética colectiva de la comunidad de virus y la diversidad del virus requiere el conocimiento de todos los miembros, independientemente de la composición del genoma. Fraccionamiento de ácidos nucleicos purificados subtipos proporciona un mecanismo eficaz para que el estudio conjuntos viral sin tener que sacrificar una parte de la firma genética de la comunidad.
Hidroxiapatita, una forma cristalina de fosfato de calcio, se ha empleado en la separación de los ácidos nucleicos, así como las proteínas y los microbios, desde 1960 11. Mediante la explotación de la interacción de cargas entre la carga positiva iones Ca 2 + de la hidroxiapatita y el esqueleto de fosfato con carga negativa de los subtipos de ácidos nucleicos, es posible eluir preferentemente cada subtipo de ácidos nucleicos independiente de los demás. Recientemente hemos empleado esta estrategia de forma independiente a fraccionar los genomas de ssDNA, dsDNA y los virus que contienen ARN en la preparación de la secuenciación del ADN 12. A continuación, presentamos un método para el fraccionamiento y la recuperación de ssDNA, dsDNA y el ARN viral ácidos nucleicos de los conjuntos mixtos viral mediante cromatografía de hidroxiapatita.
Protocol
Discussion
La metodología de la cromatografía de hidroxiapatita que aquí se presenta es una herramienta muy eficiente y robusto para el fraccionamiento de los ácidos nucleicos de los conjuntos mixtos viral, cuando el objetivo es el estudio de la composición total de ácidos nucleicos de la comunidad. Por lo general, ssDNA, el ARN y ADN de doble cadena se eluyen de la columna de las concentraciones de pho tampón fosfato mayor que 0 y 0,40 m aproximadamente ~ respectivamente. Sin embargo, cada preparación de hidroxia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por la Oficina de Ciencia (BER), EE.UU. Departamento de Energía, del Acuerdo de Cooperación no. De-FC02-02ER63453 Microbiana de la Fundación Nacional de Ciencias del Programa de la secuenciación del genoma (los números 0626826 y 0731916 premio). Agradecemos a John Glass por su experiencia y asesoramiento técnico y K. Eric Wommack por su ayuda con la recogida de muestras ambientales.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Catalogue Number |
|---|---|---|---|
| Econo-Column | Bio-Rad | 737-0717 | 0.7cm ID package/2 |
| Hydroxyapatite | Bio-Rad | 130-0520 | DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td> |
| Sodium Phosphate, Monobasic | VWR | VW1497-01 | Monohydrate, Crystal 500g |
| Sodium Phosphate, Dibasic | VWR | VW1496-01 | Anhydrous, Powder 500g |
| DEPC-treated Water | Invitrogen | AM9922 | 1L |
| 10% SDS Solution | Invitrogen | 24730-020 | UltraPure, 1L |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9262 | pH 8.0, 1L |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| 2ml serological pippette | VWR | 89130-884 | Polystyrene, Sterile |
| BD Falcon Centrifuge Tubes | VWR | 21008-936 | 15ml, Sterile |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v) | Invitrogen | 15593-031 | UltraPure, 100ml |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Device | Millipore | UFC803024 | Ultracel-30 membrane |
| 20X TE Buffer, Rnase free | Invitrogen | T11493 | 100ml |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15mg/ml |
References
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