利用羟基磷灰石色谱法从环境病毒群落中分离单链DNA、双链DNA和RNA

摘要

我们描述了一种从环境病毒群落中有效分离单链DNA、双链DNA和RNA分子的方法。该方法利用含磷酸盐缓冲液浓度递增的羟基磷灰石色谱对核酸进行分级分离。此方法可实现从环境样品中分离出所有类型的病毒核酸。

摘要

病毒，尤其是噬菌体（phages），是地球上数量最多的生物实体^1,2。病毒可调节宿主细胞的丰度和多样性，参与营养物质的循环，改变宿主细胞的表型，并通过基因的水平转移影响宿主细胞和病毒群落的进化³。大量研究已揭示了病毒在多种自然环境中惊人的遗传多样性及其功能潜力。

宏基因组学技术已被用于研究包含单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）和RNA基因型的复杂病毒群落的分类多样性及其功能潜力^4-9。目前用于研究环境样本中含DNA或含RNA病毒的文库构建方案，通常需要进行初始的核酸酶处理，以去除非目标模板¹⁰。然而，要全面理解病毒群落的整体基因组成及其多样性，必须掌握所有成员的信息，而不论其基因组组成如何。对纯化的核酸亚型进行分级分离，为研究病毒群落提供了一种有效的方法，同时避免了部分群落遗传特征的丢失。

自20世纪60年代以来，羟基磷灰石（一种结晶态的磷酸钙）已被用于核酸、蛋白质及微生物的分离¹¹。通过利用羟基磷灰石中带正电荷的Ca²⁺离子与核酸亚型中带负电荷的磷酸骨架之间的电荷相互作用，可实现不同核酸亚型的独立洗脱。我们近期应用该策略，在DNA测序前独立分离含有单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）和RNA病毒的基因组¹²。本文中，我们介绍一种利用羟基磷灰石层析法从混合病毒群落中分离并回收ssDNA、dsDNA和RNA病毒核酸的方法。

方案

1. 溶液的配制

在进行羟基磷灰石柱层析之前，必须配制磷酸盐缓冲液，并对羟基磷灰石进行充分水化处理。

1. 1 M 磷酸盐溶液，pH 6.8：在1 L烧瓶中，将119.98 g一水合磷酸二氢钠溶于1 L无菌、经DEPC处理的H₂O中₂O. 在1L容量瓶中，将141.96 g磷酸氢二钠溶于1L无菌DEPC处理的H₂O中，配制1M磷酸氢二钠溶液。₂O. 按1:1比例混合单体和二聚体溶液。将烧瓶置于搅拌器上，使用磁力搅拌子进行混合。通过添加氢氧化钠（提高pH）或磷酸（降低pH）将pH调节至6.8。
2. 0.12 M 磷酸盐缓冲液：在500 ml烧瓶中，加入30 ml 1 M 磷酸盐溶液（pH 6.8）、2.5 ml 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和5 ml 0.5 M EDTA。加入无菌的DEPC处理水至225 ml。调节pH至6.8。再用无菌的DEPC处理水定容至250 ml。高压灭菌。
3. 0.18 M 磷酸盐缓冲液：在500 ml 锥形瓶中，加入45 ml 1 M 磷酸盐溶液（pH 6.8）、2.5 ml 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和5 ml 0.5 M EDTA。加入无菌的、经DEPC处理的H₂O定容至500 ml。₂O 至 225 ml。调节 pH 至 6.8。加入无菌的 DEPC 处理过的 H₂O 至 250 ml。高压灭....

讨论

本文介绍的羟基磷灰石色谱方法是一种高效且稳健的技术，适用于在研究群落的总核酸组成时，从混合病毒群组中分离核酸。通常情况下，单链DNA（ssDNA）、RNA和双链DNA（dsDNA）将分别在磷酸盐缓冲液浓度高于约˜ 0 M、0 M和0.40 M时从色谱柱中洗脱出来。然而，每批羟基磷灰石的组成和洗脱特性可能略有差异，因此使用已知的核酸（例如来自可培养病毒制备物）对每批材料进行测试至关重要。这将使操作者能够确定洗脱目标核酸所需的含磷酸盐缓冲液的具体浓度。

该技术的一个限制因素是羟基磷灰石中可用于结合核酸磷酸骨架的可用 Ca²⁺ 离子数量。柱中羟基磷灰石的载样量可根据水夹套柱的尺寸和所用羟基磷灰石的量进行放大或缩小，洗脱缓冲液体积也可相应调整，以适应极少量或极大量的输入核酸，但最终受限于水夹套柱的尺寸。

此外，一种将核酸、羟基磷灰石和含磷酸盐缓冲液在离心管中混合，然后低速离心的批量处理方法，也可用于分离目标核酸。该策略在某些情况下可能具有优势，但其可靠性不如色谱法，后者更为准确，并能实现更好的核.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
经济型层析柱	Bio-Rad	737-0717	0.7cm 内径，每包/2 根
羟基磷灰石	Bio-Rad	130-0520	DNA 级 Bio-Gel HTP 凝胶，100g/td>
磷酸二氢钠	VWR international	VW1497-01	一水合物，晶体，500g
磷酸氢二钠	VWR international	VW1496-01	无水，粉末，500g
DEPC 处理水	Invitrogen	AM9922	1L
10% SDS 溶液	Invitrogen	24730-020	超纯级，1L
0.5M EDTA	Invitrogen	AM9262	pH 8.0，1L
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
2ml 血清移液管	VWR international	89130-884	聚苯乙烯，无菌
BD Falcon 离心管	VWR international	21008-936	15ml，无菌
苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1 v/v/v)	Invitrogen	15593-031	超纯级，100ml
Amicon Ultra-4 离心浓缩装置	EMD Millipore	UFC803024	Ultracel-30 膜
20X TE 缓冲液，RNase free	Invitrogen	T11493	100ml
蓝色糖原（Glycoblue）	Invitrogen	AM9516	15mg/ml