Cambiamenti di equilibrio nella struttura di monitoraggio RNA da 'perossidativi' e 'ossidativo' Footprinting radicale ossidrile
Summary
Questo protocollo descrive come quantificare il Mg (II)-dipendente formazione della struttura terziaria dell'RNA con due metodi di footprinting radicali idrossili.
Abstract
Molecole di RNA svolgono un ruolo essenziale in biologia. Oltre alla trasmissione di informazioni genetiche, l'RNA può piegare in unico strutture terziarie che compie un ruolo biologico specifico come regolatore, legante o catalizzatore. Informazioni sulla formazione terziaria contatto è essenziale per capire la funzione di molecole di RNA. I radicali idrossile (OH •) sono le sonde della struttura degli acidi nucleici a causa della loro elevata reattività e piccole dimensioni. 1 Quando utilizzato come sonda footprinting, i radicali idrossili mappare la superficie solvente accessibile della dorsale fosfodiestereo di DNA 1 e 2 con RNA sottile come singolo nucleotide risoluzione. Idrossile footprinting radicale può essere utilizzato per identificare i nucleotidi all'interno di una superficie di contatto intermolecolari, ad esempio nel DNA-proteina 1 e RNA-proteina complessi. Equilibrio 3 e 4 transizioni cinetica può essere determinato da condurre footprinting radicale ossidrile in funzione di una soluzione moltoil variabile o il tempo, rispettivamente. Una caratteristica fondamentale di footprinting è che l'esposizione limitata alla sonda (per esempio, 'single-hit cinetica') i risultati nel campionamento uniforme di ogni nucleotide del polimero 5.
In questo articolo il video, si usa il P4-P6 dominio del ribozima Tetrahymena per illustrare la preparazione dei campioni di RNA e la determinazione di un (II)-mediata isoterme Mg pieghevole. Descriviamo l'uso del noto protocollo di idrossile footprinting radicale che richiede H 2 O 2 (chiamiamo questo il protocollo 'perossidativi') e un valore, ma poco noto, alternativa che utilizza naturalmente disciolto O 2 (lo chiamiamo la ' ossidativo 'protocollo). Una panoramica della riduzione dei dati, la trasformazione e procedure di analisi è presentato.
Protocol
Discussion
Footprinting radicale ossidrile è uno strumento prezioso per valutare l'area solvente superficie accessibile di acidi nucleici. Formazione qualitativa e quantitativa della struttura terziaria 14 può essere seguita in funzione di parametri quali il tipo e la concentrazione di ioni, pH, temperatura, proteine di legame o pieghevoli co-fattori. La combinazione vincente di un protocollo di dritto in avanti ed economico e l'accessibilità conseguente solvente e le informazioni su un pieghevole a sin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institute of Health RO1-GM085130 e la National Science Foundation MCB0929394. Ringraziamo il Dott. Marion Schmidt per la sua ospitalità e per averci permesso di filmare nel suo laboratorio.
Materials
| Name | Company | Cat# |
|---|---|---|
| Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
| EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
| DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
| Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
| MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
| Urea | Ambion | AM9902 |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
| tRNA | Sigma | R-7876 |
| Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
| Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
| RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
| Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |
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