Мониторинг Равновесие Изменения в структуре РНК "Peroxidative» и «Окислительный" гидроксильных радикалов Footprinting
Summary
Этот протокол описывает, как количественного Mg (II)-зависимой РНК формирование третичной структуры двумя методами гидроксильных радикалов footprinting.
Abstract
Молекулы РНК играют важную роль в биологии. В дополнение к передаче генетической информации, РНК может спасовать в уникальной третичной структуры выполняют особую роль в качестве регулятора биологических, связующее или катализатор. Информация о третичном образовании контакта необходимо понимать функции молекул РНК. Гидроксильных радикалов (OH •) представляют собой уникальные зонды структуры нуклеиновых кислот из-за их высокой реакционной способностью и небольшим размером. 1 При использовании в качестве footprinting зонд, гидроксильные радикалы карте растворителя доступной поверхности фосфодиэфирных основа ДНК и РНК 1 2 с тонкая, как одиночных нуклеотидных разрешения. Гидроксильных радикалов footprinting может быть использована для идентификации нуклеотидов в межмолекулярных контактной поверхности, например, в ДНК-белковых 1 и РНК-белковых комплексов. Равновесие 3 и 4 кинетические переходы могут быть определены путем проведения гидроксильных радикалов footprinting в зависимости от solutiна переменную или времени, соответственно. Ключевой особенностью является то, что footprinting ограниченным воздействием зонда (например, "одним хитом кинетика ') приводит к равномерной выборке каждый нуклеотид полимера 5.
В этом видео статье мы используем P4-P6 области Tetrahymena рибозим, чтобы проиллюстрировать РНК подготовки проб и определения Mg (II)-опосредованной складной изотерм. Мы описываем использование известных гидроксильных радикалов протокол, который требует footprinting H 2 O 2 (мы называем это "peroxidative" протокол) и ценную, но не очень широко известно, альтернатива, которая использует естественно растворенного O 2 (мы называем это ' окислительный "протокол). Обзор обработки данных, трансформация и анализ процедур представлена.
Protocol
Discussion
Гидроксильных радикалов footprinting является ценным инструментом для оценки растворителя доступной площади поверхности нуклеиновых кислот. Качественный и количественный формирование третичной структуры 14 можно проследить как функцию параметров, таких как ион типа и концентрации,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья RO1-GM085130 и Национальный научный фонд MCB0929394. Мы благодарим доктора Марион Шмидт за гостеприимство и за предоставленную нам возможность фильма в своей лаборатории.
Materials
| Name | Company | Cat# |
|---|---|---|
| Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
| EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
| DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
| Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
| MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
| Urea | Ambion | AM9902 |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
| tRNA | Sigma | R-7876 |
| Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
| Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
| RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
| Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |
References
- Tullius, T. D., Dombroski, B. A. Hydroxyl radical “footprinting”: high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).
- Celander, D. W., Cech, T. R. Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms. 生物化学. 29, 1355-1361 (1990).
- Celander, D. W., Cech, T. R. Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule. Science. 251, 401-407 (1991).
- Sclavi, B., Sullivan, M., Chance, M. R., Brenowitz, M., Woodson, S. A. RNA folding at millisecond intervals by synchrotron hydroxyl radical footprinting. Science. 279, 1940-1943 (1998).
- Tullius, T. D., Dombroski, B. A., Churchill, M., Kam, L. Hydroxyl radical footprinting: a high-resolution method for mapping protein-DNA contacts. Methods. Enzym. 155, 537-558 (1987).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic. Acids. Res. 15, 8783-8798 (1987).
- Schlatterer, J. C., Brenowitz, M. Complementing global measures of RNA folding with local reports of backbone solvent accessibility by time resolved hydroxyl radical footprinting. Methods. 49, 142-147 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Zaug, A. J., Grosshans, C. A., Cech, T. R. Sequence-specific endoribonuclease activity of the Tetrahymena ribozyme: enhanced cleavage of certain oligonucleotide substrates that form mismatched ribozyme-substrate complexes. 生物化学. 27, 8924-8931 (1988).
- Knapp, G. Enzymatic approaches to probing of RNA secondary and tertiary structure. Methods. Enzym. 180, 192-212 (1989).
- Slatko, B. E., Albright, L. M. Denaturing gel electrophoresis for sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 7, Unit 7.6-Unit 7.6 (2001).
- Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments. RNA. 11, 344-354 (2005).
- Simmons, K., Martin, J. S., Shcherbakova, I., Laederach, A. Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA. Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).
- Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme. 生物化学. 41, 5799-5806 (2002).
- Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing. Science. 273, 1678-1685 (1996).
- Petri, V., Brenowitz, M. Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches. Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).
- Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations. J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).
- Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).
- Shcherbakova, I., Mitra, S. Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure. Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly. Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).
- Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters. RNA. 15, 189-199 (2009).
