قياس الكالسيوم السريع في تدفقاتها العضلية
Summary
نقدم طريقة سريعة لعزل الأحداث الكالسيوم (ميكروثانية) أبطأ من الدفقات في الخلايا الحية باستخدام ليزر متحد البؤر المجهر. الأسلوب التدابير تقلبات كثافة مضان من المؤشرات التي تفحص الكالسيوم خط بكسل تسجيل عدة مئات في الخلية. تحليل الرسم البياني يسمح لنا عزل جداول زمنية لتدفقات الكالسيوم مختلفة.
Abstract
العضلية لديك عدة كا 2 + تدفقات متفاوتة المدة التي تعمل معا لتحسين 1،2 وظيفة. تغييرات في كا 2 + ينظم النشاط في الغالب استجابة لعوامل خارج الخلية التي مسار فسفوليباز ف Cβ – Gα المترجمة على غشاء البلازما التي تحفزها عوامل مثل أستيل 3،4. لقد وجدنا في الآونة الأخيرة يمكن أن اصطاد تنشيط مجالات البلازما بروتين يسمى الغشاء caveolae 5،6 Gα ف 7. هذا فخ له تأثير في تحقيق استقرار الدولة في تنشيط ف Gα وما ينتج عنها من مدة طويلة في كاليفورنيا في 2 + إشارات العضلية وغيرها من أنواع الخلايا 8. وكشف لنا هذه النتيجة مفاجئة من خلال قياس ردود الكالسيوم الحيوية على نطاق والعضلية السريعة في الحي. لفترة وجيزة ، يتم تحميل خلايا مع مؤشر كا الفلورسنت + 2. في دراساتنا ، استخدمنا كا 2 + الخضراء (Invitrogen ، وفيج) الذي يسلك زيادة في كثافة الانبعاثات مضان على ربط أيونات الكالسيوم. ثم يتم تسجيل كثافة مضان لاستخدام وضع خط مسح ليزر متحد البؤر المسح المجهر. هذا الأسلوب يسمح اقتناء السريع للدوام من كثافة مضان بالبكسل على طول الخط المحدد ، وإنتاج عدة مئات من آثار الزمن على مقياس الوقت ميكروثانية. يتم نقل هذه الآثار سريع جدا في التفوق ومن ثم الى Sigmaplot للتحليل ، ومقارنة آثار حصل للضوضاء الإلكترونية ، وصبغ الحرة ، وضوابط أخرى. تشريح كا 2 + ردود معدلات تدفق مختلفة ، وأجرينا تحليلا الرسم البياني ان اهمال كثافة بكسل مع مرور الوقت. Binning يسمح لنا أكثر من 500 مجموعة آثار بمسح ووضع تصور لنتائج المترجمة مكانيا وزمانيا على قطعة واحدة. وبالتالي ، يمكن للموجات بطيئة الكالسيوم + 2 التي يصعب تمييز عندما يتم مضافين التفحص بسبب التنسيب الذروة المختلفة ، والضوضاء ، وينظر بسهولة فيرسوم بيانية للاهمال. تدفقات سريع جدا في النطاق الزمني لقياس توزيع تظهر ضيقة من شدة في صناديق وقت قصير جدا بينما تعد كا 2 + الموجات تظهر البيانات اهمال مع توزيع واسعة في صناديق لوقت أطول. هذه التوزيعات زمنية مختلفة تسمح لنا بتحليل توقيت كا 2 + الدفقات في الخلايا ، وتحديد تأثيرها على الأحداث الخلوية المختلفة.
Protocol
Discussion
طورنا طريقة لعرض وعزل إشارات الكالسيوم العضلية السريعة في الحي. بينما سبق لظروف تجريبية لهذه القياسات المطبقة على نظم خلية أخرى 10 فضلا عن 11 العضلية ، واستخدام رسوم بيانية وتحليل البيانات من بن يسمح كا كثير من 2 إلى الحصول عليها + الأحداث. يمكن أ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة والمنح 2R01 GM53132 GM071558 P50.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |
References
- Cheng, H., Lederer, M. R., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 270, 148-159 (1996).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiol. Rev. 88, 1491-1545 (2008).
- Rebecchi, M. J., Pentyala, S. N. Structure, function, and control of phosphoinositide-specific phospholipase. C. Physiol.Rev. 80, 1291-1335 (2000).
- Suh, P. Multiple roles of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes. BMB reports. 41, 415-434 (2008).
- Schlegel, A. Crowded little caves: structure and function of caveolae. Cell. Signal. 10, 457-463 (1998).
- Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199-225 (1998).
- Sengupta, P., Philip, F., Scarlata, S. Caveolin-1 alters Ca2+ signal duration through specific interaction with the G{alpha}q family of G proteins. J. Cell. Sci. 121, 1363-1372 (2008).
- Guo, Y., Golebiewska, U., Scarlata, S. Modulation of Ca2+ Activity in Cardiomyocytes through Caveolae-G[alpha]q Interactions. Biophysical. Journal. 100, 1599-1607 (1016).
- Rybin, V. O., Xu, X., Lisanti, M. P., Steinberg, S. F. Differential targeting of beta -adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase to cardiomyocyte caveolae. A mechanism to functionally regulate the cAMP signaling pathway. J. Biol. Chem. 275, 41447-41457 (2000).
- Tovey, S. C. Calcium puffs are generic InsP3-activated elementary calcium signals and are downregulated by prolonged hormonal stimulation to inhibit cellular calcium responses. J. Cell. Sci. 114, 3979-3989 (2001).
- Lohn, M. Ignition of Calcium Sparks in Arterial and Cardiac Muscle Through Caveolae. Circ. Res. 87, 1034-1039 (2000).
