מדידת Fluxes סידן מהיר ב cardiomyocytes

Summary

אנו מציגים שיטה לבודד מהירה (מיקרו) האירועים סידן והנתיבים איטי יותר בתאים חיים באמצעות לייזר מיקרוסקופיית confocal. שיטה מודד תנודות בעוצמת הקרינה של אינדיקטורים סידן על ידי קו סריקות הקלטה מאות פיקסלים מספר בתא. ניתוח היסטוגרמה מאפשר לנו לבודד את הכף זמן של והנתיבים סידן שונים.

Abstract

Cardiomyocytes יש מספר רב של Ca ^{2 +} והנתיבים משתנה משך שפועלים יחד כדי לייעל ^1,2 לתפקד. שינויים Ca ^{2 +} לפעילות בתגובה סוכני תאי מווסת בעיקר על ידי מסלול phospholipase _q Cβ-Gα מקומי על קרום הפלזמה אשר מגורה על ידי הסוכנים כגון אצטילכולין ^3,4. לאחרונה מצאנו כי חלבון הנקרא פלזמה קרום תחומים caveolae ^5,6 יכול ללכוד מופעל Gα _q ^7. מלכודת זו יש אפקט של ייצוב מצב של הפעלת Gα _q וכתוצאה מכך Ca ^{2 +} ממושכת אותות cardiomyocytes סוגי תאים אחרים ^8. חשפנו תוצאה זו מפתיעה על ידי מדידת התגובות סידן דינמי בקנה מידה מהיר cardiomyocytes חיים. בקצרה, תאים נטענים עם אינדיקטור ניאון Ca ^{+ 2.} במחקרים, השתמשנו Ca ^{2 +} ירוק (Invitrogen, בג) אשר מציג עלייה בעוצמת פליטת הקרינה על הכריכה של יוני סידן. עוצמת הקרינה היא רשמה אז לשימוש במצב קו סריקה של קרן לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal. שיטה זו מאפשרת רכישה מהירה של מהלך הזמן של עוצמת הקרינה בפיקסלים לאורך קו נבחר, לייצר כמה מאות עקבות הזמן בסולם זמן המיקרו. עקבות אלה מהר מאוד מועברים לתוך Excel ולאחר מכן לתוך Sigmaplot לניתוח, והם לעומת עקבות שהתקבלו רעש אלקטרוני, לצבוע בחינם, פקדים אחרים. כדי לנתח Ca ^{2 +} התגובות של שיעורי השטף שונות, ביצענו ניתוח ההיסטוגרמה כי זרקת לפח בעוצמות פיקסל עם הזמן. Binning מאפשר לנו קבוצה מעל 500 עקבות של סריקות לחזות את התוצאות שנאספו במרחב ובזמן על מגרש אחד. לפיכך, להאט את גלי Ca ^{2 +} שקשה להבחין כאשר הסריקות הם כיסו בשל מיקום שיא רעש שונים, ניתן לראות בקלותהיסטוגרמות זרקת לפח. והנתיבים מהר מאוד בסולם זמן המדידה להראות הפצה הצר של עוצמות של פחי זמן קצר מאוד כבר בעוד Ca ^{2 +} גלי להראות נתונים זרקת לפח עם הפצה רחבה מעל פחי זמן רב יותר. אלו הפצות זמן שונים מאפשרים לנו לנתח את התזמון של Ca ^{2 +} והנתיבים בתאים, ולקבוע את השפעתם על אירועים הסלולר השונות.

Protocol

1. תאים טוען עם אינדיקטורים סידן פלייט תאים 35mm תחתית זכוכית MatTek מנות (או כל תחתית זכוכית אחרים לתאי הצפייה). אם אתה משתמש העיקרית מעיל myocytes יום 1 לפני לתאי עם 10μg/ml laminin. פלייט myocytes לב (מבודד כלבי…

Discussion

פיתחנו שיטה להציג לבודד אותות סידן המהירה cardiomyocytes חיים. בעוד תנאי הניסוי של מדידות אלה בעבר ליישם מערכות תאים אחרים, כמו גם ¹⁰ cardiomyocytes ^11, השימוש היסטוגרמות וניתוח סל מאפשרת נתונים רבים Ca ^{2 +} אירועים להירכש. אירועי מהר ניתן לבודד בקלות מאלו ומודלים איטי…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234