测量心肌细胞的快速钙助焊剂

Summary

我们提出了一个方法来隔离在生活细胞利用激光扫描共聚焦显微镜慢通量快速（微秒）钙事件。方法措施，由几百个像素单元格中的记录行扫描荧光强度的钙指标的波动。直方图分析，让我们来隔离不同的钙通量的时间尺度。

Abstract

心肌细胞有多个时间长短不一的Ca ^{2 +}通量，共同努力，优化功能^1,2。钙的变化外代理的活动主要是受这是刺激剂， ^如乙酰胆碱3,4质膜磷脂酶_Cβ-Gαq本地化的途径。最近，我们发现，质膜蛋白质称为小窝^5,6域可以坑害激活_GαQ ^7。这包封的稳定_Gαq激活状态，并在^长期的Ca ^{2 +}信号在心肌细胞和其它类型的^细胞 8作用。我们发现这个令人吃惊的结果，通过规模快速测量动态生活心肌钙反应。简言之，装有一个荧光的^{Ca 2 +}指示剂细胞。在我们的研究中，我们使用的Ca ^{2 +}绿色（Invitrogen公司，在C.）展品钙离子结合后的荧光信号强度的增加。荧光强度，然后记录使用激光扫描共聚焦显微镜扫描模式。此方法允许沿选定的行的像素荧光强度的时间当然的快速采集，生产数百微秒的时间尺度上的时间痕迹。这些痕迹非常快转移到Excel，然后将进行分析Sigmaplot相比，电子噪音，免费染料和其他控制获得的痕迹。解剖的Ca ^{2 +}不同的通量率的反应，我们进行了直方图分析，随着时间的推移，分级像素强度。分级让我们超过500扫描的痕迹和可视化编译的结果在一个单一的情节空间和时间。因此，缓慢的Ca ^{2 +}波难以辨别时，扫描覆盖由于不同的峰的位置和噪声，可不难看出，在分级直方图。在时间尺度的测量速度非常快通量表明在很短的时间，而^较长的Ca 2箱的强度分布^窄 +波显示分级数据与广泛分布在较长的时间箱。这些不同的时间分布，让我们来剖析在细胞内^的Ca 2 +通量的时机，并确定其影响各种细胞活动。

Protocol

1。载入细胞与钙指标中板35mm玻璃底的MatTek菜细胞（或任何其他的玻璃底部观看商会）。 如果使用前用10μg/ml的层粘连蛋白大衣原发性心肌商会1天。板心肌细胞（成年犬，新生鼠，或其他生物隔离）35 KB缓冲区（K -逆转台氏缓冲mmol / L的HEPES，140 mmol / L的氯化钾，8 mmol / L的KHCO 3，2毫摩尔/ L的MgCl 2的 KH 2 PO 4，pH值7.5 0.4毫摩尔/ L）和逐步改变M199培养基?…

Discussion

我们已经开发出一种方法来查看和隔离生活心肌的快速钙信号。虽然这些测量的实验条件下，曾经被应用到其他细胞^系统10以及心肌^细胞 11，使用直方图和斌分析可以从^很多的Ca ^{2 +}事件被收购的数据。更快的事件，可以很容易地隔离较慢的适应，了解他们的底层机制的模型。培养心肌细胞，许多小学的细胞株，可就难了。虽然人们普遍认为，测量应尽快采取收购后…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234