Summary

الكمية التصوير من النسب المحددة اشارة مستقبلات بوساطة الرقم تشبه في وحيدات والخلايا الجذعية من عينات صغيرة من دم الإنسان

Published: April 16, 2012
doi:

Summary

وصفنا استخدام التكنولوجيا ImageStream (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> www.amnis.com</a>)، والذي يجمع بين كمية التدفق الخلوي في وقت واحد مع عالية الدقة التصوير الرقمي، لتحديد الآليات الخلوية لخلايا المناعة الأولية من الأفواج المريض واضحة المعالم. دراستنا توفر نموذجا للتحقيقات لتحديد نسب متعدية الاستجابات الخلوية محددة في عينات صغيرة من الأفواج الموضوع.

Abstract

الاختلافات الفردية في الحالة المناعية تحديد الردود على العدوى والمساهمة في شدة المرض والنتيجة. ويرتبط الشيخوخة مع زيادة الحساسية للالتهابات الفيروسية والبكتيرية وانخفاض القدرة على الاستجابة للقاحات مع انخفاض الموثقة توثيقا جيدا في الخلطية فضلا عن الخلية التي تتوسط فيها 1،2 الاستجابات المناعية. لقد قمنا بتقييم مؤخرا من آثار الشيخوخة على الرقم مثل مستقبلات (TLRs)، والمكونات الرئيسية للنظام المناعة الفطرية التي تكشف عن العدوى الميكروبية والزناد دفاع المضيف مضادات الميكروبات ردود 3. في لفيف كبير من الجهات المانحة البشرية الصحية، ونحن أظهرت أن حيدات الدم المحيطي من كبار السن قد انخفضت التعبير وظيفة TLRs معينة (4) ومستويات مماثلة TLR انخفاض والاستجابات يشير في الخلايا الجذعية (DCS)، مستضد تقديم الخلايا التي تقوم بدور محوري في الربط بين الحصانة الفطرية والتكيفية 5. لقد أظهرنا dysregulation من TLR3 في الضامة 1د انخفاض إنتاج الإنترفيرون من قبل البلدان النامية من الجهات المانحة المسنين في استجابة للإصابة بعدوى فيروس غرب النيل 6،7.

قصوى في فهمنا للتشيخ مناعي والتدخل العلاجي هو فهم مفصل لأنواع معينة من الخلايا الاستجابة وآلية (ق) من نقل الإشارة. لقد تقدمت الدراسات التقليدية من الاستجابات المناعية من خلال التصوير من الخلايا الأولية وعلامات الخلية المسح من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية أو طخة مناعية فهمنا بشكل كبير، ومع ذلك، وتقتصر هذه الدراسات بشكل عام من الناحية الفنية من خلال حجم عينة صغيرة المتاحة من المرضى وعدم القدرة على إجراء تقنيات مختبرية معقدة على عدة الإنسان العينات. ImageStream يجمع كمية التدفق الخلوي في وقت واحد مع عالية الدقة التصوير الرقمي، وبالتالي يسهل تحقيق في السكان الخلية متعددة متزامنة لالتقاط كفاءة قابلية المريض. نحن هنا لشرح استخدام ImageStream في البلدان النامية لتقييم TLR7 / 8تفعيل بوساطة الزيادات في الفسفرة وإزفاء النووية عامل النسخ مفتاح، NF-κB، الذي يبدأ النسخ من الجينات العديدة التي تعتبر بالغة الأهمية بالنسبة الاستجابات المناعية 8. باستخدام هذه التكنولوجيا، ونحن كما أظهرت مؤخرا تغيير غير المعترف بها من قبل من TLR5 إشارات والمسار NF-κB في حيدات من أقدم الجهات المانحة التي قد تسهم في الاستجابة المناعية المعدلة في الشيخوخة 9.

Protocol

1. العزلة وتنشيط الخلايا المناعية الحصول على 10-50 مل من الدم heparinized متطوعين أصحاء بعد الموافقة المسبقة عن كتابي في إطار المبادئ التوجيهية للمجلس مراجعة المؤسسية المحلية. يجب أن لدراسات الشيخوخة أو المرض يمكن المرضية وا…

Discussion

الخطوات الحاسمة في استخدام ImageStream للدراسات متعدية هي اختيار مجموعات المقارنة ذات الصلة، والتحسين والتحقق من نوعية الأجسام المضادة. والفروق بين الجماعات موضوع في الهدف المسمى يكون واضحا من خلال رسوم بيانية وصور الخلية. بالاشتراك مع تحليل دقيق للتغيرات في مستقبلات ذ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (N01 HHSN272201100019C، U19 089992 لمنظمة العفو الدولية، وبرنامج NCRR / GCRC M01-RR00125). الكتاب تعلن أي تضارب المصالح المالية واشكر الدكتور مارك Shlomchik، مدير مرفق خلية ييل الأساسية فارز.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03
R848 Invivogen tlrl-r848
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
BD Perm/Wash BD Biosciences 554723
CD14-PE eBioscience 12-0149-41
CD4-PacBlue BD Pharmingen 68436
Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC BD Biosciences 340546
CD11c-PE BD Biosciences 347637
CD123-PE BD Biosciences 340545
rabbit anti-NF-κB (p65) SantaCruz SC-372
Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG Invitrogen A21246
DAPI Invitrogen D21490
ImageStream X Amnis  

Table 1. Specific reagents and equipment.

Cell type FITC PE Alexa 647 PacBlue
Monocyte   CD14 NF-κB (p65)  
mDC Lin1 CD11c NF-κB (p65) CD4
pDC Lin1 CD123 NF-κB (p65) CD4

Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways

Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.

References

  1. Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
  2. Shaw, A. C. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
  3. Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
  4. van Duin, D. Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression. J. Immunol. 178, 970-975 (2007).
  5. Panda, A. Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response. J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).
  6. Kong, K. -. F. Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly. J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).
  7. Qian, F. Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus. J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).
  8. Hayden, M. S., Ghosh, S. NF-kappaB in immunobiology. Cell research. 21, 223-244 (2011).
  9. Qian, F. Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly. Aging Cell. 11, 104-110 (2011).
  10. George, T. C. Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow. Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).

Play Video

Cite This Article
Qian, F., Montgomery, R. R. Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood. J. Vis. Exp. (62), e3741, doi:10.3791/3741 (2012).

View Video