Summary

Une poli et renforcé Diluée-crâne fenêtre for Long-term imagerie du cerveau de souris

Published: March 07, 2012
doi:

Summary

Nous présentons une méthode pour former une fenêtre d'imagerie dans le crâne de la souris qui s'étend millimètres et est stable pendant des mois sans inflammation du cerveau. Cette méthode est bien adaptée pour les études longitudinales de la circulation sanguine, la dynamique cellulaire et cellulaire / structure vasculaire en utilisant la microscopie à deux photons.

Abstract

L'imagerie in vivo de la fonction corticale nécessite un accès optique au cerveau sans interruption de l'environnement intracrânienne. Nous présentons une méthode pour former un crâne poli et armé amincie (ports) fenêtre dans le crâne de la souris qui s'étend sur plusieurs millimètres de diamètre et est stable depuis des mois. Le crâne est amincie à 10 à 15 um d'épaisseur avec une perceuse à main pour réaliser une clarté optique, et est ensuite recouverte d'une colle cyanoacrylate et une vitre de protection à: 1) fournir une rigidité, 2) inhiber la repousse osseuse et 3) réduire la diffusion de la lumière des irrégularités sur la surface osseuse. Depuis le crâne n'est pas violé, une inflammation qui pourrait affecter le processus de l'étude est considérablement réduit. Des profondeurs d'imagerie allant jusqu'à 250 um en dessous de la surface corticale peut être réalisé en utilisant la microscopie biphotonique à balayage laser. Cette fenêtre est bien adapté pour étudier le débit sanguin cérébral et la fonction cellulaire dans les préparations à la fois anesthésiés et éveillés. Il offre en outre l'opportunity de manipuler l'activité des cellules à l'aide optogénétique ou d'interrompre le flux sanguin dans les vaisseaux ciblés par irradiation de la circulation photosensibilisants.

Protocol

1. Préparation pour la chirurgie i Nettoyer les outils chirurgicaux par sonication dans un mélange de lait et de chirurgie Maxizyme dans un nettoyeur à ultrasons. Autoclaver les instruments chirurgicaux avant chaque expérience. Veiller à ce que tous les réactifs nécessaires et consommables sont disponibles. Une liste des réactifs et consommables est fourni dans le tableau 2. Réactifs et consommables qui entrent en contact avec les tissus exposés doivent être stériles, lorsque …

Discussion

Imagerie biphotonique à travers une fenêtre ports exige la transmission à travers l'os aminci et la dure-mère, ce qui atténue la lumière laser et ajoute des aberrations optiques à plus grande profondeur 8. Cependant, malgré cet inconvénient, les profondeurs d'imagerie jusqu'à 250 um en dessous de la surface piale peut être atteint avec 900 nm d'excitation. Des profondeurs d'imagerie plus élevés peuvent en principe être possible avec des longueurs d'onde d'excitation p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association (post-doctoral à AYS) et le National Institutes of Health (MH085499, EB003832 et OD006831 à DK). Nous tenons à remercier Beth Friedman et Pablo Blinder pour les commentaires sur le manuscrit.

Materials

Agent Route of delivery Dose for mouse Duration Notes Source Ref Ref
Pentobarbital (Nembutal) IP 90 μg/g 15-60 min Narrow safety margin. Work up to proper dose of anesthesia slowly. Supplement 10 % of induction dose as required. 036093; Butler Schein 7
Ketamine (Ketaset) mixed with Xylazine (Anased) IP 60 μg/g (K)
10 μg/g (X) (mix in same syringe)
20-30 min Xylazine is co-injected as a muscle relaxant and analgesic. Supplement only Ketamine at 50% of induction dose as required. (K) 010177, (X) 033198; Butler Schein 7
Isoflurane (Isothesia) Inhalation 4% mean alveolar concentration (MAC) for induction; 1-2% MAC for maintenance 4-6 h. Provided in mixture of 70% oxygen and 30% nitrous oxide. Prolonged anesthesia leads to slow recovery. 029403; Butler Schein 26

Table 1. Suggested anesthetic agents for survival studies.

ITEM COMPANY CATALOG # / MODEL
Betadine Butler Schein 6906950
Buprenorphine (Buprenex) Butler Schein 031919
Fluorescein isothiocyanate dextran, 2 MDa molecular weight Sigma FD2000S
Isopropyl alcohol Fisher AC42383-0010
Lactated Ringer’s Solution Butler Schein 009846;
Lidocaine solution, 2 % (v/v) Butler Schein 002468
Saline Butler Schein 009861
Surgical Milk Butler Schein 014325
Texas Red dextran, 70 kDa molecular weight Invitrogen D1864
Maxizyme Butler Schein 035646
DISPOSABLES
Carbide burrs, 1/2 mm tip size Fine Science Tools 19007-05
Cottoned tip applicators Fisher Scientific 23-400-100
Cover Glass, no. 0 thickness Thomas Scientific 6661B40
Cyanoacrylate glue ND Industries 31428 H04308
Gas duster Newegg N82E16848043429
Grip cement powder Dentsply 675571
Grip cement solvent Dentsply 675572
Insulin syringe, 0.3 mL volume with 29.5 gauge needle Butler Schein 018384
Nut and bolt to secure the head Digikey Nut, H723-ND; bolt, R2-56X1/4-ND
Opthalmic ointment Butler Schein 039886
Scalpel blades Fisher Scientific 12-460-448
Screws, self-tapping #000 J.I. Morris Company FF000CE125
Silicone aquarium sealant Perfecto Manufacturing 31001
Tin oxide powder Mama’s Minerals EQT-TINOX
EQUIPMENT
Glass scribe Fisher Scientific 08-675
Dissecting microscope Carl Zeiss OPMI-1 FC
Electric powered drill Foredom or Osada K.1020 (Foredom) or EXL-M40 (Osada)
Electrical razor Wahl Series 8900
Forceps, Dumont no. 55 Fine Science Tools 11255-20
Feedback regulated heat pad FHC 40-90-8 (rectal thermistor, 40-90-5D-02; heat pad, 40-90-2-07)
Isoflurane vaporizer Ohmeda IsoTec4
Pulse oximeter Starr Life Sciences MouseOx
Screwdriver, miniature Garret Wade 26B09.01
Stereotaxic frame Kopf Instruments Model 900 (with mouse anesthesia mask and non-rupture ear bars)
Surgical scissors, blunt end Fine Science Tools 14078-10
Ultrasonic cleaner Fisher Scientific 15-335-30

Table 2. List of specific reagents, disposables and equipment.

References

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Cite This Article
Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (61), e3742, doi:10.3791/3742 (2012).

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