Summary

Полированные и железобетона тоньше череп-Window для долгосрочных изображений из мозга мыши

Published: March 07, 2012
doi:

Summary

Представлен метод формирования изображения окна в мышь череп, который охватывает миллиметров и стабилен в течение месяца без воспаление головного мозга. Этот метод хорошо подходит для продольного исследования кровотока, клеточной динамики, и клетка / сосудистые структуры с использованием двух-фотонной микроскопии.

Abstract

В естественных изображений корковых функций требует оптического доступа к мозгу без нарушения внутричерепного окружающей среды. Представлен метод формирования полированного и железобетонных разбавленной черепа (портов) в окно мыши череп, который охватывает несколько миллиметров в диаметре и стабилен в течение месяца. Череп разбавленной от 10 до 15 мкм в толщину с ручной буровой для достижения оптической прозрачностью, а затем обложил цианакрилатного клея и покровного стекла: 1) обеспечивает жесткость, 2) подавляют костный подроста и 3) уменьшить рассеяние света от неровностей на поверхности кости. С черепа не нарушена, любое воспаление, которое может повлиять на процесс изучается значительно снижается. Изображений глубине до 250 мкм ниже поверхности коры может быть достигнуто с помощью двухфотонного лазерной сканирующей микроскопии. Это окно хорошо подходит для изучения мозгового кровотока и клеточной функции как наркоз и проснуться препаратов. Кроме того, он предлагает опможность управлять клеточной активности использования optogenetics или нарушать кровоток в сосудах целевых облучения циркулирующего фотосенсибилизаторов.

Protocol

1. Подготовка к операции я Очистите хирургических инструментов, sonicating в смеси Maxizyme и хирургических молока в ультразвуковой очиститель. Автоклава хирургические инструменты перед каждым экспериментом. Убедитесь, что все необходимые реагенты и расходные материалы имею?…

Discussion

Двухфотонного изображений через окно портов требует передачи через разбавленной костей и твердой мозговой оболочкой, которая ослабляет свет лазера и добавляет оптических аберраций на больших глубинах 8. Однако, несмотря на этот недостаток, изображения глубиной до 250 мкм ниже пи?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа выполнена при финансовой поддержке Американской Ассоциации Сердца (пост-докторские стипендии для AYS) и Национального института здоровья (MH085499, EB003832 и OD006831 Д. К.). Мы благодарим Beth Фридман и Пабло Блиндер замечания по рукописи.

Materials

Agent Route of delivery Dose for mouse Duration Notes Source Ref Ref
Pentobarbital (Nembutal) IP 90 μg/g 15-60 min Narrow safety margin. Work up to proper dose of anesthesia slowly. Supplement 10 % of induction dose as required. 036093; Butler Schein 7
Ketamine (Ketaset) mixed with Xylazine (Anased) IP 60 μg/g (K)
10 μg/g (X) (mix in same syringe)
20-30 min Xylazine is co-injected as a muscle relaxant and analgesic. Supplement only Ketamine at 50% of induction dose as required. (K) 010177, (X) 033198; Butler Schein 7
Isoflurane (Isothesia) Inhalation 4% mean alveolar concentration (MAC) for induction; 1-2% MAC for maintenance 4-6 h. Provided in mixture of 70% oxygen and 30% nitrous oxide. Prolonged anesthesia leads to slow recovery. 029403; Butler Schein 26

Table 1. Suggested anesthetic agents for survival studies.

ITEM COMPANY CATALOG # / MODEL
Betadine Butler Schein 6906950
Buprenorphine (Buprenex) Butler Schein 031919
Fluorescein isothiocyanate dextran, 2 MDa molecular weight Sigma FD2000S
Isopropyl alcohol Fisher AC42383-0010
Lactated Ringer’s Solution Butler Schein 009846;
Lidocaine solution, 2 % (v/v) Butler Schein 002468
Saline Butler Schein 009861
Surgical Milk Butler Schein 014325
Texas Red dextran, 70 kDa molecular weight Invitrogen D1864
Maxizyme Butler Schein 035646
DISPOSABLES
Carbide burrs, 1/2 mm tip size Fine Science Tools 19007-05
Cottoned tip applicators Fisher Scientific 23-400-100
Cover Glass, no. 0 thickness Thomas Scientific 6661B40
Cyanoacrylate glue ND Industries 31428 H04308
Gas duster Newegg N82E16848043429
Grip cement powder Dentsply 675571
Grip cement solvent Dentsply 675572
Insulin syringe, 0.3 mL volume with 29.5 gauge needle Butler Schein 018384
Nut and bolt to secure the head Digikey Nut, H723-ND; bolt, R2-56X1/4-ND
Opthalmic ointment Butler Schein 039886
Scalpel blades Fisher Scientific 12-460-448
Screws, self-tapping #000 J.I. Morris Company FF000CE125
Silicone aquarium sealant Perfecto Manufacturing 31001
Tin oxide powder Mama’s Minerals EQT-TINOX
EQUIPMENT
Glass scribe Fisher Scientific 08-675
Dissecting microscope Carl Zeiss OPMI-1 FC
Electric powered drill Foredom or Osada K.1020 (Foredom) or EXL-M40 (Osada)
Electrical razor Wahl Series 8900
Forceps, Dumont no. 55 Fine Science Tools 11255-20
Feedback regulated heat pad FHC 40-90-8 (rectal thermistor, 40-90-5D-02; heat pad, 40-90-2-07)
Isoflurane vaporizer Ohmeda IsoTec4
Pulse oximeter Starr Life Sciences MouseOx
Screwdriver, miniature Garret Wade 26B09.01
Stereotaxic frame Kopf Instruments Model 900 (with mouse anesthesia mask and non-rupture ear bars)
Surgical scissors, blunt end Fine Science Tools 14078-10
Ultrasonic cleaner Fisher Scientific 15-335-30

Table 2. List of specific reagents, disposables and equipment.

References

  1. Cetin, A. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1, 3166-3173 (2006).
  2. Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes. Journal of Comparative Neurology. 375, 89-108 (1996).
  3. Driscoll, J. D., Yuste, R. Quantitative two-photon imaging of blood flow in cortex. Imaging in Neuroscience and Development. , 927-937 (2011).
  4. Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extends arteriole capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 108, 8473-8473 (2011).
  5. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678-e678 (2008).
  6. Zhang, S. Rapid reversible changes in dendritic spine structure in vivo gated by the degree of ischemia. Journal of Neuroscience. 25, 5333-5338 (2005).
  7. Takano, T. Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 9, 260-267 (2006).
  8. Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
  9. Marker, D. F. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. Journal of Visualized Experiments. (43), e2059-e2059 (2010).
  10. Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  11. Martin, C. Investigating neural-hemodynamic coupling and the hemodynamic response function in the awake rat. Neuroimage. 32, 33-48 (2006).
  12. Shih, A. Y. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2011).
  13. Kobat, D. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17, 13354-13364 (2009).
  14. Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4, 1128-1144 (2009).
  15. Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10, 549-551 (2007).
  16. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  17. Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8, 752-758 (2005).
  18. Ascenzi, A., Fabry, C. Technique for dissection and measurement of refractive index of osteons. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 6, 139-142 (1959).
  19. Stosiek, C. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
  20. Grinvald, A. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
  21. Dunn, A. K. Dynamic imaging of cerebral blood flow using laser speckle. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, 195-201 (2001).
  22. Villringer, A. Capillary perfusion of the rat brain cortex: An in vivo confocal microscopy study. Circulation Research. 75, 55-62 (1994).
  23. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  24. Srinivasan, V. J. Optical coherence tomography for the quantitative study of cerebrovascular physiology. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31, 1339-1345 (2011).
  25. Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. Journal of Biomedical Optics. 15, 011101-011101 (2010).
  26. Flecknell, P. A. . Laboratory animal anesthesia. , (1987).

Play Video

Cite This Article
Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (61), e3742, doi:10.3791/3742 (2012).

View Video