Die α-Test: Rapid Zellfreie CD4-Zählung mit ganzen Speichel

Summary

Eine Aufzählung CD4-Methode, die α-Test, beschrieben, nutzt ganzen Speichel auf eine schnelle und genaue CD4-Werten geben. Die α-Test kostet Pfennige und eliminiert die Notwendigkeit für technische Schulungen, teure Reagenzien wie monoklonale Antikörper, Mess-, Kälte-, Transport der Proben, sowie Sammlung und Handhabung von Blut.

Abstract

Es besteht ein dringender Bedarf an erschwinglichen CD4-Enumeration, um HIV-Erkrankung zu überwachen. CD4-Zählung ist außerhalb der Reichweite in Regionen mit begrenzten Ressourcen aufgrund der Zeit und Temperatur Einschränkungen, technische Raffinesse, und die Kosten für Reagenzien, insbesondere monoklonale Antikörper gegen CD4 auf Blutzellen, die einzige derzeit akzeptable Methode zu messen. Eine häufig verwendete kostengünstige und zeitsparende Labor Strategie ist es, zu berechnen, anstatt Maßnahme bestimmte Blutwerte. Zum Beispiel werden LDL-Spiegel unter Verwendung der gemessenen Werte von Gesamtcholesterin, HDL und Triglyceride ^1. Somit zählt Identifizierung von zellfreien korreliert, die direkt regulieren die Anzahl der CD4 ⁺ T-Zellen konnte eine genaue Methode zur Berechnung CD4 bereitzustellen aufgrund der physiologischen Bedeutung der korreliert.

Die Anzahl der Stammzellen, die Blut eintreten und bestimmt zu werden zirkulierender CD4 ⁺ T-Zellen wird durch das Chemokin CXCL12 einer bestimmtennd seinen Rezeptor CXCR4 durch ihren Einfluss auf die Fortbewegung ^2. Verfahren nach Stammzellen Bewegung in Blut wird zusätzlich durch Zelloberfläche menschliche Leukozyten-Elastase (HLE _CS) und dem HLE _CS-reaktiven aktiven α _{1-Proteinase-Inhibitor} (α ₁ PI, α _{1-Antitrypsin,} SERPINA1) ³ geregelt. In HIV-1-Erkrankung, ist α ₁ PI inaktiviert durch Krankheitsprozesse ^4. In den frühen Gruppen von asymptomatischen HIV-1 Erkrankung, wurde die aktive α ₁ PI zufolge unter werden in 100% der unbehandelten HIV-1-Patienten (M = 12 pM, und ein normales während der symptomatischen Kategorien ^{4, 5 zu} erreichen normal. Diese Muster hat Immunsystem Inaktivierung zugeschrieben, nicht ausreichend Synthese proteolytischen Inaktivierung oder Sauerstoff. Wir beobachteten, dass bei HIV-1-Patienten mit> 220 CD4-Zellen / ul, CD4-Zahlen mit Serum Spiegel der aktiven α ₁ PI korreliert (r ² = 0,93, p &lt; 0,0001, n = 26) und inaktive α ₁ PI (r ² = 0,91, p <0,0001, n = 26) ^5. Die Verabreichung von α ₁ PI, um HIV-1 infizierten und nicht infizierten Probanden führte zu dramatischen Anstieg der CD4-Zellzahl darauf hindeutet, α ₁ PI beteiligt an der Regulation der Anzahl der CD4 ⁺ T-Zellen im Blut ^3.

Mit Stimulation, enthält ganze Speichel ausreichend seröse Exsudat (Plasma, das verbleibende Material, das durch Wände der Blutgefäße in den Speichel übergeht), damit die Messung von aktiven α ₁ PI und die Korrelation dieser Messung gibt Hinweise, dass es eine genaue Methode zur Berechnung der CD4-Zellzahl ist. Kurz gesagt, stimulieren sialogogues wie Kaugummi oder Zitronensäure die Exsudation von Serum in ganzen Mund Speichel. Nach Stimulation Serum Exsudation, wird die Aktivität von Serum α ₁ PI im Speichel durch seine Fähigkeit, Elastase-Aktivität zu hemmen gemessen. Schweine-Pankreas-Elastase (PPE)ist ein leicht verfügbares preiswerten Quelle für Elastase. PPE bindet an α ₁ PI Bilden einer eins-zu-eins-Komplex, der verhindert, PPE Abspaltung ihrer spezifischen Substraten, von denen die kolorimetrische Peptid ist, Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-Nitroanilid (SA ³ NA). Inkubation von Speichel mit einer sättigenden Konzentration von PSA für 10 Minuten bei Raumtemperatur ermöglicht die Bindung von PSA an alle aktiven α ₁ PI im Speichel. Die daraus resultierende Hemmung der PSA, die unter aktiver α ₁ PI kann durch Zugabe des PSA-Substrat SA ³ NA. (Abbildung 1) gemessen werden. Obwohl CD4 in Bezug auf das Blutvolumen (CD4-Zellen / ul) gemessen werden, wird die Konzentration an α ₁ PI im Speichel zu der Konzentration von Serum im Speichel und nicht die für die Menge der Speichel da das Volumen beträchtlich variieren während des Tages und Person bis ⁶ Personen. Es ist praktisch das gesamte Protein im Speichel durch Serumgehalt, und das Protein von Speichel wird gemesversicherbar ^7. Somit wird aktiven α ₁ PI im Speichel im Verhältnis zum Speichel Proteingehalt berechnet und wird als α ₁ PI-Index. Hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die α ₁ PI-Index eine genaue und präzise physiologische Verfahren zur Berechnung CD4 bietet.

Protocol

1. Bereiten Sie frische Arbeitskopie Lösungen TBS: 0,05 M Tris-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,8 (TBS). Bereiten Sie 60 ml TBS / Mikroplatten. PSA: Schweine-Pankreas-Elastase, Typ 1 (PSA) wird als Suspension zur Verfügung gestellt. Gut schütteln und verdünnen PSA in TBS auf etwa 0,01 U / ml. Bereiten Sie 6 ml Arbeitslösung / Mikroplatten). SA 3 NA: Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA 3 NA). Bereiten 0,1…

Discussion

Unverdünntes Serum enthält Median 36 um α ₁ PI und 3,6 um α ₂ Makroglobulin (α ₂ M) ein 10-facher Unterschied ^8. Beide Proteine ​​um die Bindung an PSA. Diese beiden Eigenschaften, Konzentration und PPE Affinität, wurden genutzt, um ein Verfahren, das imstande ist, spezifisch Messen α ₁ PI in normalem Serum in Gegenwart von konkurrierenden α ₂ M ⁸ zu entwickeln. Diese Methode kann so wenig wie 50 nM μ ₁ PI in 0,3% Serum …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sialogogue, 0.05M citric acid	Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144	Sugar-Free Lemon dropS
Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103	E1250
Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760
Coomassie Brilliant Blue R-250	Sigma-Aldrich	B7920
Tissue culture-treated, 96 well microplates	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886	35-3072
Microplate Reader with filters for 405 nm and 595 nm	MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182	Dynex P97277