El α-test: Rapid libre de células CD4 enumeración utilizando toda la saliva

Summary

Un método de enumeración de CD4, la α-test, se describe que utiliza toda la saliva para proporcionar recuentos de células CD4 rápidos y precisos. Las pruebas α-cuesta centavos y elimina la necesidad de formación técnica, reactivos costosos, como los anticuerpos monoclonales, instrumentación, refrigeración, transporte de muestras, así como la recolección y el manejo de sangre.

Abstract

Hay una necesidad urgente para el recuento de CD4 asequibles para controlar la enfermedad del VIH. Recuento de CD4 está fuera del alcance de las regiones con recursos limitados, debido a la restricciones de tiempo y temperatura, la sofisticación técnica, y el costo de los reactivos, en particular los anticuerpos monoclonales para medir los CD4 en las células de la sangre, el único método aceptable. Una estrategia de uso común de ahorro de costes y ahorro de tiempo de laboratorio consiste en calcular, en lugar de medir los valores sanguíneos determinados. Por ejemplo, los niveles de LDL se calculan utilizando los niveles medidos de colesterol total, HDL y triglicéridos ^1. Por lo tanto, la identificación de células libres de los correlatos que regulan directamente el número de células CD4 ⁺ T podría proporcionar un método exacto para calcular el recuento de células CD4, debido a la importancia fisiológica de las correlaciones.

El número de células madre que entran a la sangre y están destinados a convertirse en circulación células T CD4 ⁺ está determinada por la quimioquina CXCL12 unª de su receptor CXCR4, debido a su influencia sobre la locomoción ^2. El proceso de la locomoción de las células madre en sangre es, además, regulada por la superficie celular elastasa de leucocitos humanos (HLE _CS) y la ELH _CS-reactivo activo α ₁ inhibidor de proteinasa (PI ₁ α, α ₁ antitripsina, SERPINA1) ^3. En la enfermedad de VIH-1, α ₁ PI está inactiva debido a procesos de la enfermedad ^4. En las categorías primeros asintomáticos de VIH-1 enfermedad, activo α ₁ PI se encontró que era inferior a lo normal en el 100% de VIH-1 no tratados los pacientes (mediana = 12 mM, y para lograr niveles normales durante las categorías sintomáticas ^{4, 5.} Este patrón se ha atribuido a la inactivación inmune, no a la síntesis insuficiente, la inactivación proteolítica, o la oxigenación. Hemos observado que en VIH-1 sujetos con CD4> 220 células / l, el recuento de CD4 se correlaciona con los niveles séricos de PI activo α ₁ (R ² = 0,93, p &lt; 0.0001, n = 26) y los inactivos α ₁ PI (R ² = 0,91, p <0,0001, n = 26) ^5. La administración de α ₁ PI al VIH-1 en individuos infectados y no infectados como resultado aumentos significativos en los recuentos de CD4 que sugieren α ₁ PI participa en la regulación del número de células T CD4 ⁺ en la sangre ^3.

Con la estimulación, toda la saliva contiene exudado seroso suficiente (plasma que contiene material proteínico que pasa a través de las paredes de los vasos sanguíneos en la saliva) para permitir la medición de la actividad α ₁ PI y la correlación de esta medida es evidencia de que es un método preciso para calcular los recuentos de CD4. En pocas palabras, sialogogos tales como la goma de mascar o ácido cítrico estimula la exudación de suero en la saliva toda la boca. Después de la estimulación exudación de suero, la actividad de suero α ₁ PI en la saliva se mide por su capacidad para inhibir la actividad de la elastasa. Elastasa pancreática porcina (EPP)es una fuente barata fácilmente disponibles de la elastasa. PPE se une a α ₁ PI formando un complejo uno-a-uno que evita PPE de escindir sus sustratos específicos, uno de los cuales es el péptido colorimétrico, succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (SA ³ NA). Incubando saliva con una concentración de saturación de PPE durante 10 min a temperatura ambiente permite la unión de PPE a toda la sesión α ₁ PI en la saliva. La inhibición de PPE por activo α ₁ PI puede ser medido mediante la adición del PPE sustrato SA ³ de NA. (Figura 1). Aunque los recuentos de CD4 se miden en términos de volumen de sangre (células CD4 / l), la concentración de α ₁ PI en la saliva se relaciona con la concentración de suero en la saliva, no al volumen de la saliva puesto que el volumen puede variar considerablemente durante el día y persona a persona ^6. Sin embargo, prácticamente toda la proteína en la saliva es debido al contenido de suero, y el contenido en proteínas de la saliva es MEAmensurable ^7. Por lo tanto, activa α ₁ PI en la saliva se calcula como la relación al contenido de proteínas y la saliva se denomina α ₁ Índice de PI. Los resultados presentados en este documento demuestran que la α ₁ Índice de PI proporciona un método fisiológico exacto y preciso para el cálculo de los recuentos de CD4.

Protocol

1. Preparar soluciones frescas de Trabajo TBS: 0,05 M de Tris Buffered Saline pH, 7,8 (TBS). Preparar 60 ml de TBS / microplaca. EPI: elastasa pancreática porcina, de tipo 1 (EPP) se proporciona como una suspensión. Agitar bien y diluir PPE en TBS a aproximadamente 0,01 U / ml. Preparar 6 ml de solución de trabajo / microplaca). SA 3 NA: succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (SA 3 NA). Prepare 0,1 M de valores …

Discussion

Suero sin diluir contiene la mediana de 36 mM α ₁ PI y 3,6 mM α ₂ macroglobulina (α ₂ M), una diferencia de 10 veces ^8. Ambas proteínas competir por la unión a EPI. Estas dos características, la concentración y la afinidad del PPE, se han explotado para desarrollar un método que es capaz de medir específicamente α ₁ PI en el suero normal en presencia de competir α ₂ M ^8. Este método puede detectar cantidades tan pequeñas como 50 μ…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sialogogue, 0.05M citric acid	Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144	Sugar-Free Lemon dropS
Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103	E1250
Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760
Coomassie Brilliant Blue R-250	Sigma-Aldrich	B7920
Tissue culture-treated, 96 well microplates	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886	35-3072
Microplate Reader with filters for 405 nm and 595 nm	MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182	Dynex P97277