التوصل إلى فهم مستوى النظم من العمليات الخلوية هو هدف بيولوجيا الخلية في العصر الحديث. نحن هنا وصف استراتيجيات للصحفيين وسيفيراز المتنوعة من مختلف وظيفة الخلوية نقطة نهاية لاستجواب وظائف الجينات باستخدام الجينوم على نطاق والمكتبات رني.
الاستجواب على نطاق الجينوم وظيفة الجين باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي (رني) يحمل وعدا هائلا لتحديد السريع للين العريكة كيميائيا نقاط الضعف الخلايا السرطانية. مما يحد من إمكانيات هذه التكنولوجيا هو عدم القدرة على ترسيم بسرعة أساس الآلية من نتائج المظهري وبالتالي يسترشد بها في وضع استراتيجيات علاجية تستهدف جزيئيا. نحن هنا الخطوط العريضة الأساليب لتفكيك الظواهر الخلوية الناجمة عن الجين رني بوساطة استهداف باستخدام أنظمة مراسل المضاعفة التي تسمح رصد سرطان مفتاح عمليات الخلية المرتبطة. هذه المنهجية الفرز نسبة عالية هي متعددة ويمكن تكييفه بسهولة لفحص أنواع أخرى من مكتبات الجزيئية كبيرة.
مجموعة متنوعة من الصحفيين على وسيفيراز لرصد مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية خلية متاحة تجاريا. غالبية هذه البروتينات الحمض النووي يبني ترميز وسيفيراز التي يسببها وصريح من قبل المحفزات خلية معينة أو اضطرابات. الأكثر صحفيين قوية مقرها transcriptionally وضع التعبير عن انزيم luciferase المراسل تحت سيطرة عناصر محسن الاصطناعية أو مناطق المروج الجين راسخة لموثوقيتها في الإبلاغ عن ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية النسخي 1،2 حدث. وهناك أيضا نظم عبر مراسل luciferase التي تستخدم GAL4-UAS لدفع وسيفيراز تعبير البروتين. GAL4 هي الخميرة النسخي المنشط وUAS هو محسن الذي يربط GAL4 خصيصا لتفعيل النسخ من تسلسل الجينات وضعت أسفل تيار من ذلك 3. وعادة ما يتم اعتماد هذه الأنواع من أنظمة وسيفيراز من قبل اثنين من البلازميدات الحمض النووي – واحد بترميز البروتين GAL4 تنصهر إلى regulatoراي جزء من البروتين من الفائدة، والثاني يشفر بروتين وسيفيراز وضعت تحت سيطرة واحدة أو أكثر UAS متواليات. وهكذا، فإن إشارة وسيفيراز الخلوية يعكس مستوى النشاط من البروتين من الفائدة. آخر الاستخدام المشترك للصحفيين المستندة إلى وسيفيراز هو لرصد استقرار البروتين حيث يتم تنصهر بروتين من الفائدة إلى إنزيم وسيفيراز 4. بغض النظر عن نوع من المراسل، ويلاحظ على مسؤولية المشتري هنا كما لا يستطيع المرء تحمل خصوصية أي مراسل لتم استجوابه بشكل جيد. وبالتالي، مطلوب العناية الواجبة في إدماج بنيات مراسل جديدة في أي استراتيجية للبحوث.
اختيار الانزيم وسيفيراز قراءة خارج يمكن أن تكون مهمة مثل الاعتماد على عناصر DNA التي تتحكم في التعبير عنها. في حين luciferase يراعة (FL) هو انزيم الأكثر استخداما في التركيبات المتاحة تجاريا، وظهور أنظمة مراسل luciferase الجديدة التي لا تتطلب ATP (كما في حالةمن ردود الفعل على أساس FL) أو التي تتضمن الإنزيمات أكثر استقرارا التي تنبعث منها إشارات أقوى نعد لتحسين كفاءة وموثوقية منصة الأبحاث هذه. ملاحظة هامة فيما يتعلق باختيار صحفيين وسيفيراز في الدراسات الكيميائية هو قابلية FL على تثبيط المواد الكيميائية التي يمكن أن تؤدي إلى تقارير كاذبة. في تجربتنا، والإنزيمات الأخرى مثل Renilla أو Gaussia وسيفيراز (RL وGL، على التوالي) التي تستخدم coelenterazine باعتبارها الركيزة هي تثبيط أقل بسهولة بواسطة الجزيئات الصغيرة 5.
الشكل الأكثر شيوعا لتعدد وسيفيراز قراءة عموميات تنطوي على استخدام FL وRL نظرا إلى حد كبير بتوافر سهلة الاستخدام لمجموعات مع القدرة على قياس بالتسلسل الأنشطة الأنزيمية من عينة واحدة. في معظم مجموعات، ويتعرض العينات الأولى للوسيفيرين للكشف عن مستويات النشاط FL تليها كاشف التبريد التي يتم إيداعها في وقت واحد مع coelenterazine أن تسفر عن الشركة السعوديةدارى RL إشارة. مع إضافة luciferases الأخرى التي يمكن أن يفرز مثل GL أو التي تستخدم حتى الآن الركيزة أخرى مثل Cypridina وسيفيراز (CL)، وهو عدد أكبر من إمكانيات لتوليد ظهرت محتوى البيانات عالية باستخدام luciferases. مثال على شاشة رني الجينوم على نطاق باستخدام هذه التقنية يمكن العثور عليها هنا 6. هذه التقدم التكنولوجي قد بدوره حفز تطوير آليات محددة لإرواء كل نوع من انزيم luciferase المراسل من أجل الحد عبر الحديث 7. في أيدينا، ونحن نلاحظ تردد أكبر من "آثار الحافة" (الاتجاهات لا يمكن تفسيره في النشاط الخلوي المرتبطة حافة عالية لوحات ثقافة عيار)، مع luciferases يفرز مثل GL أو CL. من ناحية أخرى، مثل luciferases يفرز هي مفيدة لفحوصات الحركية كما أنها تمكن أخذ العينات إشارة دون غش بقاء الخلية.
لدراستنا المعروضة هنا، وسوف نقوم في نفس الوقت مراقبة النشاط من ثلاثة السرطان ذات الصلةالعمليات الخلوية: وP53، KRAS، وWNT مسارات نقل الإشارة. للصحفيين أدرجت في دراستنا هي FL مراسل pp53-TA-لوك من Clontech (المشار إليه فيما مراسل P53-FL) 8، نظام مراسل Elk1-GAL4/UAS-CL (من الآن فصاعدا إلك-1 المراسل؛ اجيلنت)، وTCF مراسل RL 8X الذي يشتمل على عدة عناصر محسن الاصطناعية معترف بها من قبل WNT مسار المنظمين النسخي المعروف باسم العوامل تي خلية (أو TCFs) 9-11.
وهناك العديد من مروجي أنظمة المستندة إلى مراسل luciferase المراسل (مثل PROMEGA، نظم الاستهداف، نيو انغلاند Biolabs، والحرارية فيشر) التي توفر الموارد على الخط مفيدة لأولئك مسلية شاشة عالية الإنتاجية للمرة الأولى. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن عددا من الاستعراضات ممتازة بشأن تحقيق ?…
The authors have nothing to disclose.
ونحن نعترف الدعم المالي من CPRIT (RP100119) ومؤسسة وولش (I-1665).
REAGENTS | |||
PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
EQUIPMENT | |||
MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 |