Una piattaforma di screening Luciferase basata multiplex per interrogare il cancro-associata trasduzione del segnale in cellule in coltura

Summary

Il raggiungimento di un livello di sistemi di comprensione dei processi cellulari è un obiettivo di biologia cellulare moderna. Descriviamo qui le strategie per multiplazione reporter luciferasi di varia funzione cellulare end-point per interrogare la funzione del gene utilizzando genoma scala librerie di RNAi.

Abstract

Interrogatorio genoma scala della funzione genica mediante RNA interference (RNAi) è di enorme speranza per l'identificazione rapida delle chimicamente trattabili vulnerabilità delle cellule tumorali. Limitando il potenziale di questa tecnologia è l'incapacità di delineare rapidamente la base meccanicistica dei risultati fenotipici e quindi informare lo sviluppo di strategie terapeutiche a bersaglio molecolare. Noi descriviamo qui i metodi di decostruire fenotipi cellulari indotti dal gene di RNAi mediato il targeting utilizzando sistemi reporter canalizzati che permettono il monitoraggio del cancro chiave processi associati alle cellule. Questa metodologia screening ad alto contenuto è versatile e può essere facilmente adattato per lo screening di altri tipi di grandi librerie molecolari.

Introduction

Una varietà di reporter luciferasi-based per il monitoraggio di una gamma diversificata di processi biologici cellulari sono disponibili in commercio. La maggioranza di questi DNA costruisce codificare proteine ​​luciferasi che sono indotte ad esprimere da stimoli specifici delle cellule o perturbazioni. La maggior parte dei giornalisti robusti transcriptionally basati inserire l'espressione di un enzima luciferasi sotto il controllo di elementi enhancer sintetici o regioni promotore del gene ben stabiliti per la loro affidabilità nel riportare una fisiologicamente rilevanti ^1,2 evento trascrizionale. Ci sono anche sistemi trans-reporter luciferasi che utilizzano GAL4-UAS per guidare l'espressione della proteina luciferasi. GAL4 è un lievito attivatore trascrizionale e la SUP è un enhancer di GAL4 che si lega specificamente ad attivare la trascrizione di sequenze geniche poste a valle di esso ^3. Questi tipi di sistemi di luciferasi sono tipicamente supportate da due plasmidi DNA – una codifica la proteina GAL4 fusa al regulatory porzione di una proteina di interesse, e il secondo codifica una proteina luciferasi posto sotto il controllo di una o più sequenze UAS. Così, il segnale luciferasi cellulare riflette il livello di attività della proteina di interesse. Un altro uso comune di reporter luciferasi è basati per monitorare la stabilità proteica quale una proteina di interesse è fuso ad un enzima luciferasi ^4. Indipendentemente dal tipo di giornalista, un caveat emptor viene qui notare come non si può assumere la specificità di qualsiasi reporter di essere stato ben interrogato. Così, due diligence è richiesta la costituzione di nuovi costrutti reporter di qualsiasi strategia di ricerca.

La selezione dell'enzima luciferasi read-out può essere importante quanto l'affidabilità dei elementi di DNA che controllano l'espressione. Considerando lucciola luciferasi (FL) è l'enzima più comunemente usato in costrutti disponibili in commercio, l'avvento di nuovi sistemi di luciferasi che non richiedono ATP (come nel casodi reazioni FL-based), o che incorporano enzimi più stabili che emettono segnali forti promettono di migliorare l'efficienza e l'affidabilità di questa piattaforma di ricerca. Una nota importante per quanto riguarda la selezione dei reporter luciferasi in studi chimici è la suscettibilità di FL di inibizione chimica che potrebbe dare luogo a falsi rapporti. Nella nostra esperienza, altri enzimi come Renilla o Gaussia luciferasi (RL e GL, rispettivamente) che utilizzano come substrato coelenterazina sono meno facilmente inibito da piccole molecole ^5.

Il formato più comune per multiplazione luciferasi read-out comporta l'uso di FL e RL largamente data la disponibilità di facile da usare kit con la capacità di misurare sequenzialmente attività enzimatiche da un singolo campione. Nella maggior parte kit, i campioni vengono prima esposti a luciferina per rivelare livelli di attività FL seguiti da un reagente tempra che viene contemporaneamente depositati presso coelenterazina per produrre una secondasegnale RL dary. Con l'aggiunta di altri luciferases che possono essere secreti come GL o che utilizzano ancora un altro substrato quale Cypridina luciferasi (CL), un numero maggiore di possibilità per la generazione di dati di alta contenuti utilizzando luciferases sono emerse. Un esempio di un genoma schermo RNAi utilizzando questa tecnica può essere trovato qui ^6. Questi progressi tecnologici hanno a loro volta stimolato lo sviluppo di meccanismi specifici per placare ogni tipo di enzima luciferasi per limitare diafonia ^7. Nelle nostre mani, si nota una maggiore frequenza di "effetti di bordo" (tendenze inspiegabili in attività cellulare associato alla periferia di piastre di coltura ad alto titolo), con luciferases secrete come GL o CL. D'altra parte, tali luciferases secrete sono utili per saggi cinetici quanto consentono di campionamento del segnale senza adulterare vitalità cellulare.

Per il nostro studio qui presentato, avremo contemporaneamente monitorare l'attività dei tre cancro rilevantiprocessi cellulari: il p53, Kras, e Wnt vie di trasduzione del segnale. I giornalisti incorporati nel nostro studio sono il pp53-TA-Luc FL giornalista Clontech (d'ora in poi indicato come il giornalista p53-FL) ^8, un sistema giornalista Elk1-GAL4/UAS-CL (d'ora in poi Elk-1 giornalista, Agilent), e la 8X TCF RL giornalista che incorpora più elementi enhancer sintetici riconosciuti dalle Wnt pathway regolatori trascrizionali noti come fattori di cellule T (o TCF) ^9-11.

Protocol

Intero protocollo impiega circa 4 giorni. 1. Preparazione di cellule per siRNA e Reporter Transfezione Introdurremo qui un protocollo per interrogare librerie di siRNA utilizzando un piccolo insieme di siRNA (384 diversi siRNA piscine array in formato a 96 pozzetti con ogni pool composto da siRNA 4x Targeting per un singolo gene) da una libreria siRNA genoma a scopo illustrativo. Per questo particolare studio, sfrutteremo HCT116 cellule che esibiscono devianti segn…

Representative Results

Nonostante i progressi nella mappatura del paesaggio mutazionale di vari tipi di cancro che utilizzano enormi sforzi di sequenziamento del genoma 12-14, noi ancora non abbiamo in atto un approccio sistematico per la traduzione di queste osservazioni nelle strategie di intervento. Nel cancro del colon-retto (CRC), le mutazioni che si prevede di colpire i componenti di tre processi cellulari – Wnt / β-catenina, p53, e Kras segnalazione – si trovano nel 99% di tutti i tumori che suggeriscono che i fattori train…

Discussion

Ci sono diversi fornitori dei sistemi reporter luciferasi-based (come ad esempio Promega, sistemi di puntamento, New England Biolabs, e Thermo Fisher) che forniscono utili risorse on-line per coloro intrattenere uno schermo ad alta produttività per la prima volta. Inoltre, una serie di ottime recensioni riguardo ottimizzare l'uso di schermi high-throughput per la scoperta del gene e come base di RNAi risultati di screening possono essere integrati con altri dataset-omiche basate dovrebbe essere utile ^15,16.</s…

Materials

			REAGENTS
PathDetect Elk1 Trans-Reporting System	Agilent Technologies Inc.	219005
Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector	Clontech Lab Inc.	631914
Effectene Transfection Reagent	Qiagen Inc.	301427
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega Corp.	E1960
Cypridina Luciferase Assay reagent	Targeting Systems	VLAR-1
HCT116 cells	ATCC	CCL-247
CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay	Promega Corp.	G9260
			EQUIPMENT
MultiFlo Microplate Dispenser	Labsystems Inc.	Model 832
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation	Beckman Coulter Inc.	A31842
PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader	BMG Labtech Inc.	0471-101A
Bright-Line Reichert Hemacytometers	Hausser Scientific Company	1490