Steady-state, Pre-steady-state, en Single-omzet Kinetic Meting voor DNA Glycosylase Activiteit
Summary
Tijd cursussen voor de glycosylase activiteit van 8-oxoguanine DNA glycosylase zijn bifasisch vertonen een uitbarsting van de productie, en een lineaire steady-state fase. Met behulp quench-waardeberekening, de burst en steady-state prijs kan worden gemeten, die overeenkomen met excisie van 8-oxoguanine en afgifte van de glycosylase uit het product DNA, respectievelijk.
Abstract
Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) snijdt de mutagene oxidatieve DNA letsel 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) uit DNA. Kinetische karakterisering van OGG1 wordt ondernomen om de tarieven van de 8-oxoG excisie en release van een product te meten. Wanneer de OGG1 concentratie minder dan substraat DNA, tijdsverloop van productvorming zijn bifasisch een snelle exponentiële fase (dwz burst) van productvorming wordt gevolgd door een lineaire steady-state fase. De initiële uitbarsting van productvorming overeen met de enzymconcentratie goed gesloten het substraat en de burst amplitude afhankelijk van de enzymconcentratie. De eerste-orde snelheidsconstante van de burst overeenkomt met de intrinsieke frequentie van 8-oxoG excisie en de lage steady-state snelheid meet de snelheid van product afgifte (product DNA dissociatiesnelheidsconstante, koff). We beschrijven hier steady-state, pre-steady-state, en single-omzet benaderingen te isoleren en te meten specifieke stappen tijdens OGG1 katalytische fietsen. Een fluorescent gelabelde laesie-bevattende oligonucleotide en gezuiverd OGG1 worden gebruikt om nauwkeurige kinetische metingen te vergemakkelijken. Aangezien lage enzymconcentraties worden gebruikt om steady-state metingen, handmatig mengen van reagentia en afschrikken van de reactie te maken kan worden uitgevoerd om de steady-state rate (k off) vast te stellen. Bovendien, extrapolatie van de steady-state rate naar een punt op de Y-as op nul moment geeft aan dat een uitbarsting van de productie, zich tijdens de eerste omzet (dwz de y-as is positief). De eerste-orde snelheidsconstante van de exponentiële burst fase kan worden gemeten met een snelle menging en uitdovingstechniek die de hoeveelheid gevormd product op korte tijdsintervallen (<1 sec) voor de steady-state fase onderzoekt en komt overeen met de snelheid van 8 -oxoG excisie (dwz chemie). De chemische stap kan ook worden gemeten met behulp van een enkel-omzet benadering waarbij katalytische fietsen isvoorkomen door verzadigen substraat met het enzym DNA (E> S). Deze benaderingen kunnen meten elementaire snelheidsconstantes die invloed hebben op de efficiëntie van de verwijdering van een DNA letsel.
Introduction
Een aëroob milieu haast genomische instabiliteit. Een belangrijke promutagene DNA letsel als gevolg van oxidatieve stress is 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). Dit komt door de dubbelzinnige codering potentieel van 8-oxoG. Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) is verantwoordelijk voor het initiëren base excisie reparatie van 8-oxoG. De glycosylase activiteit van OGG1 snijdt de 8-oxoG base resulteert in product-DNA met een apurinische website (AP-site). Een zwakke lyase activiteit van OGG1 kan de AP-plaats incisie in sommige gevallen.
Kinetische karakterisering van DNA glycosylases wordt algemeen gesteld dat ze vertonen bifasische tijd cursussen. Na een eerste snelle fase van de vorming van product (ie burst), wordt een lineaire steady-state fase waargenomen 1-3. Dit gedrag is een indicatie van een stap na chemie (dwz vormverandering of release van een product) worden snelheidsbeperkende tijdens het lineaire gedeelte van de tijd natuurlijk, terwijl de boore fase, vaak aangeduid als de aanloopfase overeenkomt met productvorming aan het enzym actieve plaats tijdens de eerste cyclus van de reactie. Wanneer het product release is snelheidsbeperkende tijdens de steady-state fase, activiteit metingen wordt een kwalitatieve maatstaf van product DNA bindingsaffiniteit, maar bieden geen kinetische informatie over gebeurtenissen in het enzym actieve plaats (dwz chemie). Dienovereenkomstig worden methoden om de exponentiële pre-steady-state salvofase isoleren en te meten die nodig is om gebeurtenissen tijdens de eerste enzymatische omzet aan het enzym actieve plaats 4 sonde.
Er zijn drie standaard kinetische benaderingen van de katalytische gedrag van OGG1 karakteriseren, (1) steady-state, (2) pre-steady-state, en (3) single-omzet. Deze benaderingen verschillen van elkaar door de enzymconcentratie in het reactiemengsel en de enzym substraat verhouding gebruikt in elke benadering. In een typisch steady-state benadering,soms aangeduid als meerdere omzet kinetiek, zijn lage concentraties enzym om de vorming te volgen. Het substraat concentratie veel groter is dan het enzym concentratie zodat meerdere enzymatische omzet hebben geen significante invloed substraat concentratie. In deze situatie dient een cursus lineair zijn en het is vaak moeilijk om te onderscheiden of een burst tijdens de eerste omzet door de lage concentratie enzym in deze benadering, Burst-amplitude is gelijk aan de enzymconcentratie. Dit kan worden ondervangen door een hogere enzymconcentratie en lineaire extrapolatie van de tijdsduur tot nul tijd te detecteren of de eerste enzymatische omzet zich snel. Het snijpunt langs de ordinaat (y-as) moet evenredig met de enzymconcentratie zijn en verschaft een maat voor het actief enzym met substraat. Hoewel deze benadering kan in beginsel bewijs voor het bestaan van een burst fase een diflende benadering vereist de kinetica van de salvofase meten. In veel gevallen de salvofase te snel te meten door handmatige vermenging en afschrikken technieken. In deze situatie, pre-steady-state en single-omzet kinetische (dwz transiënte kinetische) zal vaak een snel mengen en afschrikken instrument vroege tijdstippen van reactie 5 volgen. In een pre-steady-state benadering hoge concentraties enzym worden gebruikt, zodat een aanzienlijke hoeveelheid product wordt gevormd tijdens de eerste omzet. Aangezien meerdere omzet gevolgd voor katalytische fietsen (de lineaire fase die de volgende burst) observeren substraatconcentratie hoger is dan de enzymconcentratie ([enzyme] <[substraat]). Om gebeurtenissen te isoleren op de actieve plaats van het enzym zonder katalysator fietsen, zijn single-omzet condities benut. In dit geval is verzadigd met substraat-enzym (E >> S) zodat al het substraat i deelnemenn de 'single omzet' en zal vertonen typisch een enkel-exponentiële tijdsverloop.
Zoals hierboven is opgemerkt voor enzymen die een uitbarsting fase, product release (k off) vertonen vaak beperkt de snelheid van de steady-state fase van het tijdsverloop. De snelheid van product afgifte (v ss, conc. / Tijd) kan worden bepaald uit de helling van de lineaire steady-state fase. De actieve enzymconcentratie (E) is nodig om de snelheid van product afgifte converteren een intrinsieke snelheidsconstante waarbij koff = v ss / [E]. Belangrijk is dat de actieve enzymconcentratie doorgaans lager is dan de eiwitconcentratie gemeten door verontreinigingen, inactieve enzym, niet-productief gebonden aan substraat, en de methode voor eiwitconcentratie te bepalen. De actieve enzymconcentratie kan worden bepaald uit de burst amplitude als product release traag. Zo extrapoleren een steady-state tijdsverloop aanzero tijd geeft een schatting van actief enzym nodig om te berekenen k off (product release) van de waargenomen steady-state rate.
Om de kinetiek van de burst te meten, een pre-steady-state benadering is noodzakelijk om de vorming product volgen gedurende de eerste omzet die optreedt voorafgaand aan de lineaire steady-state fase. De burst kinetiek volgt de vorming van enzym-intermediair product. Nadat de reactie wordt gestart door het mengen van enzym met substraat, de hoeveelheid enzym-product snel toe totdat het reactiemengsel een stationaire fase bereikt. Als katalyse veel sneller dan product release, de amplitude van de burst gelijk is aan actief enzym en de waargenomen exponentiële benadering van evenwicht (k obs) overeenkomt met de snelheid van chemische omzetting waarmee het substraat in product, ervan uitgaande dat de snelheid van omgekeerde chemie is verwaarloosbaar.
In sommige gevallen katalytische cyvastklampen interfereert met een pre-steady-state-analyse, zoals wanneer de grootheden van de tarieven voor de chemie en de release van een product zijn niet significant verschillend. In dit geval, gebruik overmaat enzym ten opzichte van substraat voorkomt katalytische fietsen en beperkingen substraat gebonden enzym met een enkele omzet. Dienovereenkomstig kan de eerste chemische reactiestap als de eerste-orde snelheidsconstante (k obs) worden geïsoleerd en nauwkeurig bepaald. Dit percentage moet constant zijn vergelijkbaar met k obs bepaald uit de pre-steady-state benadering hierboven beschreven.
Hier beschrijven we hoe deze kinetische benaderingen kunnen worden gebruikt om de glycosylase activiteit van OGG1 analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kinetische benaderingen die hier beschreven schetsen methoden om elementaire kinetische constanten definiëren. Als een tijdsverloop van formatie product is bifasisch met de eerste enzymatische omzet snel optredende, dan is een stap na de chemie is snelheidsbeperkende tijdens de daaropvolgende katalytische omzet. Bij OGG1, kan de eerste omzet gemeten met behulp van hoge concentraties enzym met hetzij beperkt (S <E) of hoge (S> E) DNA concentraties. In het eerste geval wordt de reactie beperkt tot 'single-om…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Julie K. Horton voor kritische lezing van het manuscript en Dr Rajendra Prasad voor nuttige suggesties en discussies. Delen van dit onderzoek werden oorspronkelijk gepubliceerd in The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al. 'DNA Sequence Context Effecten op de Glycosylase activiteit Menselijke 8-oxoguanine DNA Glycosylase. "J Biol Chem. 287, 36.702-36.710 (2012) 2. Dit werk werd ondersteund, in zijn geheel of gedeeltelijk, door de National Institutes of Health Research Project Grant Z01-ES050158 in de Intramurale Research Program, NIEHS.
Materials
| Reagent/Material | |||
| 5′-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5′-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software |
References
- Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. 生物化学. 37, 14756-14764 (1998).
- Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).
- Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a “pinch-pull-push” mechanism. The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases. Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).
- Kovtun, I. V., et al. OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells. Nature. 447, 447-452 (2007).
- Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair. Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).
- Waters, T. R., Swann, P. F. Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).
- Nilsen, H., et al. Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase. The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).
- Van de Berg, ., Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change. The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).
- Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases. 生物化学. 47, 1043-1050 (2008).
- Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG. 生物化学. 39, 14984-14992 (2000).
- Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts. 生物化学. 49, 1658-1666 (2010).
- Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2. 生物化学. 42, 11373-11381 (2003).
- Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination. 生物化学. 47, 7626-7636 (2008).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence. 生物化学. 48, 6655-6663 (2009).
- Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY. 生物化学. 44, 14179-14190 (2005).
- Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer. DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity. DNA Repair. 1, 661-670 (2002).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion. DNA Repair. 10, 887-896 (2011).
- Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases. 生物化学. 43, 11596-11604 (2004).
- Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease. DNA Repair. 6, 317-328 (2007).
