DNAグリコシラーゼ活性の定常状態、プレ定常状態、およびシングルターンオーバー速度論的測定
Summary
8 – オキソグアニンDNAグリコシラーゼのグリコシラーゼ活性のための時間のコースには、製品の形成と線形定常段階のバーストを示す二相性である。クエンチフロー法を利用して、バースト定常状態速度は、それぞれ、製品のDNAグリコシラーゼからの8 – オキソグアニンおよび放出の切除に対応する、測定することができる。
Abstract
ヒト8 – オキソグアニンDNAグリコシラーゼ（OGG1）は、DNAから8 – オキソ-7,8 – dihydroguanine（8 – oxoG）変異原性酸化的DNA損傷部を切除。 OGG1の運動特性評価は8 oxoG切除と製品リリースの速度を測定するために行われる。 OGG1濃度は、基質DNAよりも低い場合には、生成物形成の経時変化は二相であり、生成物形成の迅速な指数期（ すなわちバースト）直鎖定常相が続く。生成物形成の初期バーストが正しく基板上に係酵素の濃度に相当し、バースト振幅は、酵素の濃度に依存する。一次速度バーストの定数は8-oxoG切除の極限速度に対応しており、遅い定常状態速度は製品リリースの速度（製品DNA解離速度定数、kは オフ ） を測定。ここでは、属を分離して測定するために、定常状態、予め定常状態、およびシングルターンオーバーのアプローチを説明OGG1触媒サイクリング中ecific手順。蛍光ラベルされた病変を含むオリゴヌクレオチドおよび精製OGG1は、正確な運動の測定を容易にするために使用されています。低酵素濃度は、定常状態測定値は、反応の試薬 の混 合を手動焼入れを行うために使用されるので、定常状態速度（kは オフ ）を確認するために行うことができる。さらに、ゼロ時間で、縦軸上の点に定常速度の外挿は、製品の形成のバーストが最初のターンオーバー（ つまり、y切片が正である）中に発生したことを示します。指数バースト位相の一定の一次速度は、定常状態位相の前に短い時間間隔（<1秒）に形成された生成物の量を検査し、8のレートに対応する迅速な混合および急冷法を用いて測定することができる-oxoG切除（ すなわち化学）。触媒サイクルがどこにある化学的工程は、シングルターンオーバーアプローチを用いて測定することができる酵素飽和基質DNA（E> S）によって阻止。これらのアプローチは、DNA損傷の除去効率に影響を及ぼすの基本速度定数を測定することができる。
Introduction
好気性の環境は、ゲノムの不安定性を早める。酸化ストレスに起因する大規模な前変異DNAの病変は、7,8 – ジヒドロ-8 – オキソグアニン（8-oxoG）です。これは8-oxoGの曖昧なコーディングの可能性があるためです。ヒト8 – オキソグアニンDNAグリコシラーゼ（OGG1）は、8 oxoGの塩基除去修復を開始するための責任があります。アプリンサイト（AP-サイト）で、製品のDNAの結果8-oxoGベースOGG1消費税のグリコシラーゼ活性。 OGG1の弱いリアーゼ活性は、いくつかの例では、AP-サイトを切開することができます。
のDNAグリコシラーゼの運動特性評価は、一般的に、彼らは二相性のタイムコースを示すことを発見。生成物形成の初期段階に高速（ すなわちバースト）後、線形定常状態位相は1-3観察される。この動作は、いがのに対し、タイムコースの直線部分の間に律速されている化学（ すなわちコンホメーション変化や製品のリリース）は、次の手順を示すものである多くの場合、一過性相と称される第相は、反応の最初のサイクルの間に酵素活性部位での生成物の形成に相当する。製品のリリースは、定常状態フェーズにおいて律速である場合には、活性測定は、製品のDNA結合親和性の定性的な指標を提供しますが、酵素活性部位（ すなわち化学）でのイベントに関する運動情報を提供していません。したがって、指数前定常状態バースト位相を分離して測定するための方法は、酵素の活性部位4で最初の酵素ターンオーバー時にイベントを調査するために必要とされる。
（1）定常状態、（2）予め定常状態、（3）シングルターンオーバーOGG1の触媒挙動を特徴付けるために3つの標準的な運動のアプローチが存在する。これらのアプローチは、反応混合物中の酵素の濃度と各アプローチにおいて利用基質比の酵素によって互いに異なる。典型的な定常状態のアプローチでは、時には、複数の回転動力学と呼ばれる酵素の低濃度は、製品の形成に従うために使用される。複数の酵素のターンオーバーが大幅に基質濃度に影響を与えないように、基質濃度が大幅に酵素濃度を超えています。この状況では、経時変化は、線形である必要があり、それがバーストこの方法で使用される低酵素濃度に起因する第ターンオーバー中に発生したかどうかを識別することは困難であり、バースト振幅は酵素濃度と等価であることに注意してください。これは、より高い酵素濃度を用いて第一の酵素のターンオーバーを迅速に発生したかどうかを検出するゼロ時間への線形時間経過を外挿することによって克服することができる。縦軸の切片（y軸）は酵素濃度に比例して、積極的に基板と係酵素の尺度を提供するべきである。このアプローチでは、原理的にはバースト位相の存在の証拠、DIFを提供することができますがferentアプローチは、バースト位相の速度を測定する必要がある。多くの場合、バースト位相は、手動混合焼入れの技術によって測定することが速すぎる。この状況では、前定常状態およびシングルターンオーバー運動（ すなわち一過性運動）は、しばしば反応5の初期の時点に従わ急速混合および消光楽器を必要と近づく。予め定常状態のアプローチでは、高濃度の酵素製品は、かなりの量の第一の代謝回転の間に形成されるように使用される。複数のターンオーバー、触媒サイクリング（ すなわちバーストに続く直線位相）を観察するために続いているので、基質濃度は、酵素濃度（[酵素] <[基板]）より大きい。触媒循環せず、酵素の活性部位でのイベントを分離するために、シングルターンオーバー条件が利用される。この場合、基板は、基板の全ては、私に参加するように、（E >> S）酵素で飽和されているn 'はシングルターンオーバー "とは、一般に単一指数関数時間経過を示す。
バースト位相は、製品のリリース（K オフ ） を示す酵素を上記のように、しばしば時間コースの定常段階のレートを制限します。製品リリース（V SS、濃/時間）の速度は、線形定常状態位相の傾きから決定することができる。活性酵素濃度（E）は、一定の内在的速度に製品リリースのレートを変換するために必要とされるここで、k オフ = V SS / [E]。重要なことに、活性酵素の濃度は、典型的に不純物、不活性酵素、非生産的に基材に結合した酵素、およびタンパク質濃度を決定するために使用される方法に起因する測定されたタンパク質濃度よりも低い。製品リリースが遅いとき活性酵素濃度は、バースト振幅から決定することができる。したがって、定常状態の時間経過にを外挿するゼロ時間は、観測された定常状態速度からK オフ （製品リリース）を計算するために必要な活性酵素の推定値を提供します。
バーストの動態を測定するには、あらかじめ定常状態アプローチは線形定常段階の前に発生最初離職中に製品の形成に従うことが必要である。バースト動態は、酵素製品中間体の形成に従う。反応は基質との混合酵素によって開始された後に反応が定常状態位相に達するまで、酵素生成物の量が急激に増加する。触媒作用ははるか迅速な製品リリースより長い場合は、バーストの振幅が想定して、製品への基質の化学変換のレートに対応均衡に積極的に従事し、酵素と観測された指数関数的なアプローチ（K OBS）に等しいと逆率化学はごくわずかです。
場合によっては、触媒CYでしがみつくような化学と製品リリースの速度の大きさが大きく異なっていない場合など、事前定常解析を妨害する。この場合、基板への過剰な酵素を用いた相対的な、単一の代謝回転の酵素と結合した触媒循環を制限基板を防止する。一次速度定数（kは OBS）などに応じて、反応の第一の化学的工程を単離することができ、正確に判定する。この速度定数は、上記プレ定常状態アプローチから決定OBS kのようになります。
ここでは、これらの運動のアプローチはOGG1のグリコシラーゼ活性を分析するために使用することができる方法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
運動アプローチは小学校速度定数を定義する方法を概説し、ここで説明。生成物形成の経時変化が急激に発生した第二相酵素の売上高がある場合、化学反応後の工程は、その後の触媒ターンオーバーの際の律速である。 OGG1の場合には、第一の売上高のいずれか（S <E)または高(S> E）DNA濃度を制限することで、高い酵素濃度を用いて測定することができる。前者の場合、反応は、 '単売?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は有益な提案や議論のための原稿とラジェンドラ·プラサドの重要な読書のための博士ジュリーK.ホートンに感謝します。本研究の一部は、もともと生物化学 、サッサA らのジャーナルに掲載された。ら 、 "ヒト8 -オキソグアニンDNAグリコシラーゼのグリコシラーゼ活性上のDNAシーケンス文脈効果。" J BIOLケム 。287、36702から36710（2012）2。この作品は、学内研究プログラムにおける保健研究プロジェクトグラントZ01-ES050158の国立研究所、NIEHSにより、全部または一部を、サポートされていました。
Materials
| Reagent/Material | |||
| 5′-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5′-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software |
References
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