عزل وتوصيف البروتينات التعبير عن مدينة Chimeric الإنسان باستخدام البروتين A غشاء Adsorbers وسير عمل مبسطة
Summary
بالمقارنة مع الكروماتوغرافيا تقارب التقليدية باستخدام البروتين Agarose حبة معبأة الأعمدة، البروتين A غشاء الممتزات يمكن أن تسرع بشكل كبير العزل المختبرية على نطاق الأجسام المضادة وغيرها من البروتينات Fc التعبير عن جزء. ويمكن أن تزيد أساليب التحليل والتقدير الكمي المناسبة من تسريع معالجة البروتين، مما يسمح بإكمال العزل/التوصيف في يوم عمل واحد، بدلا من 20 ساعة عمل.
Abstract
يمكن إنجاز المقياس المختبري لتنقية الجزيئات الحيوية من الجزيئات الحيوية من الحيوانات الخارقة زراعة الخلايا وحلول الخلايا المتحللة باستخدام الكروماتوغرافيا تقارب. في حين أن الكروماتوغرافيا تقارب باستخدام البروتين المسامية حبات agarose معبأة في أعمدة يمكن القول إن الطريقة الأكثر شيوعا لعزل نطاق المختبر من الأجسام المضادة والبروتينات المؤتلفة التعبير عن شظايا Fc من IgG، يمكن أن يكون عملية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. الوقت والقيود المالية شاقة بشكل خاص في مختبرات العلوم الأساسية الصغيرة التي يجب استرداد مئات ميكروغرام لكميات ملليغرام من البروتين من المحاليل المخففة، ولكن تفتقر إلى الوصول إلى أنظمة توصيل السائل الضغط العالي و / أو الموظفين ذوي الخبرة في التركيبات الحيوية. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي تحديد كمية المنتج وتوصيفه أيضا إلى إطالة وقت المعالجة بشكل مفرط على مدى عدة أيام عمل وتضخيم النفقات (المواد الاستهلاكية والأجور وما إلى ذلك). لذلك، هناك حاجة إلى بروتوكول سريع وغير مكلف وفعال في الوقت الذي يتم فيه عزل الأجسام المضادة والبروتينات الأخرى التي تمتلك شظية Fc وتوصيفها على نطاق المختبر. وتحقيقا لهذه الغاية، وضعنا بروتوكولا يمكن أن يكمله موظفون تقنيون محدودو الخبرة في أقل من 9 ساعات (يوم عمل واحد تقريبا) وبسرعة 4 ساعات، على عكس الأساليب التقليدية التي تتطلب أكثر من 20 ساعة عمل. معظم المعدات المطلوبة متاحة بسهولة في العلوم الطبية الحيوية القياسية، والكيمياء الحيوية، ومختبرات الهندسة الكيميائية (الحيوية)، وجميع الكواشف متوفرة تجاريا. لإثبات هذا البروتوكول ، يتم تقديم نتائج تمثيلية تم فيها دمج murine galectin-1 في Fc البشري (Gal-1hFc) من فلورة زراعة الخلايا باستخدام بروتين ممزوج بالغشاء A. تم قياس كمية Gal-1hFc المنقى باستخدام إجراء تحليل النشاف الغربي المعجل وتميز باستخدام قياس التدفق الخلوي. ويمكن تعديل سير العمل المبسط للبروتينات الأخرى المعبرة عن ال FC، مثل الأجسام المضادة، و/أو تغييره ليشمل أساليب بديلة للقياس الكمي والتوصيف.
Introduction
يمكن تحقيق عزل الأجسام المضادة والبروتينات المؤتلفة التي تعبر عن شظايا الغلوبولين المناعي G (IgG) Fc من الخلايا المستنشقة ومحلولات الخلايا المميعة المخففة باستخدام البروتين الكروماتوغرافيا المتقاربة. في مختبرات العلوم والهندسة الأساسية والصناعة ، والأعمدة معبأة مع بروتين مسامية A المغلفة agarose والزجاج ، أو الخرز البوليمري هي الأكثر شيوعا للكروماتوغرافيا تقارب ، على الرغم من ارتفاع التكاليف المالية وأوقات المعالجةالطويلة 1-3. ومن الامتنان أن تقارب الكروماتوغرافيا يمثل أكبر حساب ومعالجة عنق الزجاجة في كل من المختبر والإعدادات الصناعية2،4. ونتيجة لذلك، تم تطوير العديد من التحسينات لتقليل التكلفة ووقت المعالجة دون التضحية باسترداد المنتج بشكل عام من قطار العملية1,2,5-7. واعدة بشكل خاص لعزل الأجسام المضادة وغيرها من البروتينات التي تعبر عن Fc هو الكروماتوغرافيا تقارب باستخدام البروتين A غشاء adsorber2,5,7-10. في حين أن التقاط Fc في كروماتوغرافيا العمود محدود الانتشار(أي أن البروتين المعبر عن Fc يجب أن ينتشر داخل المسام الداخلية وعبرها للوصول إلى غالبية البروتين A) مع انخفاض الضغط العالي عبر العمود ، فإن النقل الجماعي في الأغشية الممتزة مدفوع بالحماس الحراري السائب ، مما يؤدي إلى تجنب قيود الانتشار8،9،11،12. وبالإضافة إلى ذلك، انخفاض الضغط عبر غشاء الممتز منخفضة، مما يسمح أسرع معدلات تدفق التغلغل مقارنة مع الأعمدة معبأة حبة8،9،11،12. وبالتالي ، بالنسبة لعزل النطاق المختبري ، من المتوقع أن يقلل لون الغشاء من وقت العزل لعدة ساعات ويزيد من التقاط المنتج مقارنة بالكروماتوغرافيا العمودية. وعلاوة على ذلك، تم اقتراح نماذج رياضية لامتزاز IgG في الأغشية adsorbers8،9،11،12، مما يسمح للمستخدمين النهائيين للتنبؤ الأداء في المختبر.
وثمة اختناق آخر في مختبرات العلوم والهندسة الأساسية هو توصيف البروتين المعبر عن ال FC. ومع ذلك ، فإن اختيار الطرق المناسبة لإكمال اختبارات التوصيف ، مثل هذه البقع الغربية ، يمكن أن يقلل إلى حد كبير من الوقت الذي يقضيه في اختبار المنتج. على سبيل المثال، نقل شبه مجفف في نظام عازل متقطع يمكن إنجاز نقل البروتينات الكهربائية من هلام SDS-PAGE إلى غشاء ثنائي فلوريدين متعدد الفينيل (PVDF) في غضون دقائق، في مقابل 1-2 ساعة في نقل خزان (الرطب) في نظام عازل مستمر13.
ويرد هنا وصف بروتوكول سريع وغير مكلف وفعال لعزل وتوصيف بروتين الاندماج الشيمي الذي يعبر عن جزء Fc من IgG البشري. معظم المعدات متاحة بسهولة في العلوم الطبية الحيوية الأساسية القياسية والبيولوجيا والكيمياء ومختبرات الهندسة الكيميائية (الحيوية) ، وجميع الكواشف متوفرة تجاريا. على الرغم من أن النتائج التمثيلية تم إنشاؤها من عزل وتوصيف بروتين الانصهار الموريني galectin-1/human Fc chimeric protein (Gal-1hFc) ، يمكن تطبيق البروتوكول المبسط على عزل الجزيئات الأخرى التي تمتلك جزءا من Fc ، مثل الأجسام المضادة ، أو شظايا Fc نفسها ، أو بروتينات الاندماج Fc الأخرى. وقد انخفضت التحسينات بشكل كبير وقت المعالجة (أقل من 4 ساعات ولكن عادة ~ 9 ساعة ، مقارنة مع 20 + ساعات العمل) مع تحقيق استرداد المنتج مماثلة أو محسنة مقارنة بالطرق القياسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطوير البروتوكول الموصوف هنا لعزل وتوصيف بروتين الاندماج الشيمي الذي يعبر عن Fc البشري (Gal-1hFc) بسرعة ، دون المساس بشكل كبير باسترداد المنتج أو تضخيم التكلفة. المكونات الرئيسية لسير العمل المبسطة هي بروتين ممتز غشاء للعزلة ، ونقل شبه مجفف والمناعة بمساعدة الفراغ لتوصيفها عن طريق النشاف ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يشكرا السيد لويس ف. دلغاديو (قسم الهندسة الكيميائية والجزئية الحيوية، جامعة أوهايو)، والسيد ماثيو ويليامز (قسم الهندسة الكيميائية والجزيئات الحيوية، جامعة أوهايو)، والدكتور فيليبرتو سيدينو – لوران (مستشفى بريغهام ومستشفى النساء وكلية الطب بجامعة هارفارد) على المساعدة التقنية الخبيرة. الكتاب أيضا أن أشكر شتاء 2011 CHE 404/BME 504 و خريف 2012 CHE 4830/BME 5830 الطلاب (قسم الهندسة الكيميائية والبيولوجية الجزيئية وبرنامج الهندسة الطبية الحيوية, جامعة أوهايو) للحصول على المشورة التقنية والمناقشة. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) منحة أدوات البحوث الرئيسية CBET-1039869 (MMB)، NSF CBET-1106118 (MMB)، منحة أبحاث مؤسسة الأمراض الجلدية A050422 (SRB)، المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة NCI 1R15CA 161830-01 (MMB)، زمالة ما بعد الدكتوراه NIH Kirschstein-NRSA F32CA144219-01A1 (SRB)، NIH/NCI R01CA173610 (CJD)، ومنحة NIH NCCAM R01AT004628 (CJD).
Materials
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12–A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O’Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O’Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
