Изоляция и характеристика химерных человеческих fc-выражать протеины используя протеин Адсорберы мембраны и обтекаемый рабочий процесс
Summary
По сравнению с традиционной хроматографией сродства с использованием белка агароза бисероубитарные колонки, мембранные адсорберы белка A могут значительно ускорить лабораторно-масштабную изоляцию антител и других фрагмент-экспрессионных белков Fc. Надлежащие методы анализа и количественной оценки могут еще больше ускорить обработку белка, что позволит завершить изоляцию/характеристику за один рабочий день, а не за 20 часов работы.
Abstract
Лабораторный масштаб до промышленной очистки биомолекул от супернатантов клеточной культуры и лизированных клеточных растворов может быть выполнен с помощью хроматографии сродства. Хотя сродство хроматографии с использованием пористого белка Агароза бисер упакованы в колонки, возможно, наиболее распространенным методом лабораторного масштаба изоляции антител и рекомбинантных белков, выражают Fc фрагменты IgG, это может быть трудоемким и дорогостоящим процессом. Время и финансовые ограничения особенно огромны в небольших базовых научных лабораториях, которые должны восстановить сотни микрограммов до миллиграммовых количеств белка из разбавленных растворов, но не имеют доступа к системам доставки жидкостей высокого давления и/или персоналу, опыту в биоразделение. Кроме того, количественная оценка и характеристика продукции могут также чрезмерно удлинять время обработки в течение нескольких рабочих дней и завышать расходы (расходные расходы, заработная плата и т.д.). Таким образом, быстрый, недорогой, но эффективный протокол необходим для лабораторной изоляции масштаба и характеристики антител и других белков, обладающих фрагментом Fc. С этой целью мы разработали протокол, который может быть завершен ограниченным опытом технического персонала менее чем за 9 часов (примерно один рабочий день) и так же быстро, как 4 часа, в отличие от традиционных методов, которые требуют 20 часов работы. Большинство необходимого оборудования легкодоступно в стандартных биомедицинских науках, биохимии и (био) лабораториях химической инженерии, и все реагенты доступны на коммерческой основе. Чтобы продемонстрировать этот протокол, репрезентативные результаты представлены, в которых химерин галектин-1 сливается с человеком Fc (Gal-1hFc) из клеточной культуры супернатант был изолирован с помощью белка мембраны AdSorber. Очищенный Gal-1hFc был количественно оценен с помощью ускоренной процедуры анализа западного blotting и характеризовался использованием цитометрии потока. Оптимизированный рабочий процесс может быть изменен для других белков, выражаюющих Fc, таких как антитела, и/или изменен для включения альтернативных методов количественной оценки и характеристики.
Introduction
Изоляция антител и рекомбинантных белков, выражаюющих иммуноглобулин G (IgG) Fc фрагменты из клеточной культуры supernatants и разбавления облизатических клеточных растворов может быть достигнуто с помощью белка сродство хроматографии. В фундаментальных научно-технических лабораториях и промышленности, колонны упакованы с пористым белком Агароза, стекло, или полимерные бусы чаще всего используются для сродства хроматографии, несмотря на высокие финансовые затраты и длительноевремя обработки 1-3. Это хорошо оценили, что сродство хроматографии представляет собой крупнейший счет и обработка узкое место в лабораторных ипромышленных условиях 2,4. В результате, многочисленные улучшения были разработаны для снижения затрат и времени обработки без ущерба для общего восстановления продуктаот процесса поезд 1,2,5-7. Особенно перспективным для изоляции антител и других белков, выражаюющих Fc, является сродство хроматографии с использованием белка мембраны А adorber2,5,7-10. В то время как fc захвата в колонке хроматографии диффузии ограничено(т.е. Fc-экспрессии белка должны диффузии в и через внутренние поры, чтобы достичь большинства белка А) с высоким давлением падение по всей колонке, массовый транспорт в мембранных адсорберов приводит к массовой конвекции, в результатечего избежать диффузии ограничения 8,9,11,12. Кроме того, падение давления через мембрану adorber является низким, что позволяет быстрее перфузии скорости потока по сравнению с бисером упакованыколонны 8,9,11,12. Таким образом, для изоляции лабораторных масштабах, мембранная хроматография, по прогнозам, сократит время изоляции на несколько часов и увеличит улавливание продукта по сравнению с колонкой хроматографии. Кроме того, математические модели для IgG adorption в мембранных адсорбенахбыли предложены 8,9,11,12, что позволяет конечных пользователей прогнозировать производительность в лаборатории.
Еще одним узким местом в фундаментальных научно-технических лабораториях является характеристика белка Fc-expressing. Тем не менее, выбор соответствующих методов для завершения анализа характеристик, таких западных помарки, может значительно сократить время, затученные на тестирование продукта. Например, полудровый переход в прерывистой буферной системе может выполнить электрофоретический перенос белков из геля SDS-PAGE в мембрану поливинила дифторидина (PVDF) в считанные минуты, в отличие от 1-2 часов в баке (мокрый) передачи в непрерывной буфернойсистеме 13.
Быстрый, недорогой и эффективный протокол, чтобы изолировать и охарактеризовать химерный синтез белка, выражаюго Fc фрагмент человека IgG описывается здесь. Большинство оборудования легкодоступно в стандартных базовых биомедицинских науках, биологии, химии и (био) лабораториях химической инженерии, и все реагенты доступны на коммерческой основе. Хотя репрезентативные результаты были получены в результате изоляции и характеристики murine galectin-1/human Fc химерного белка синтеза (Gal-1hFc), обтекаемый протокол может быть применен к изоляции других молекул, обладающих фрагментом Fc, таких как антитела, сами фрагменты Fc или другие белки синтеза Fc. Наши улучшения значительно сократили время обработки (всего за 4 часа, но, как правило, на 9 часов, по сравнению с 20 часами работы) при одновременном достижении аналогичного или улучшенного восстановления продукта по сравнению со стандартными методами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный в этом, был разработан для быстрой изоляции и характеристики химерного синтеза белка, выражаюго человека Fc (Gal-1hFc), без существенного ущерба для восстановления продукта или завышения стоимости. Ключевыми компонентами обтекаемого рабочего процесса являются белок ме…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить г-на Луиса Ф. Дельгадильо (департамент химической и биомолекулярной инженерии, Университет Огайо), г-на Мэтью Х. Уильямса (департамент химической и биомолекулярной инженерии, Университет Огайо) и д-ра Филиберто Седено-Лорана (Brigham and Women’s Hospital и Harvard Medical School) за экспертную техническую помощь. Авторы также хотели бы поблагодарить Зимой 2011 CHE 404/BME 504 и осень 2012 CHE 4830/BME 5830 студентов (Департамент химической и биомолекулярной инженерии и биомедицинской инженерной программы, Университет Огайо) за технические консультации и обсуждения. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (NSF) Основные исследования инструментов грант CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Дерматология Фонд исследований Грант A050422 (SRB), Национальные институты здравоохранения (NIH) NCI грант 1R15CA161830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Постдокторская стипендий F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD), и NIH NCCAM грант R01AT004628 (CJD).
Materials
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12–A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O’Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O’Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
