阻隔组织破坏与有机电化学晶体管传感
Summary
有机电化学晶体管集成了活细胞，并用于监视整个胃肠道上皮屏障离子流。在本研究中，增加了离子通量，涉及到中断紧密连接的，诱导的钙螯合剂EGTA（乙二醇 – 双（β-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸的存在下酸），进行测定。
Abstract
胃肠道是阻挡薄纸，可提供针对病原体和毒素的条目的物理屏障，同时允许必要的离子和分子的推移的一个例子。在此屏障违反可以通过在细胞外钙离子浓度的降低而引起。这减少了钙的浓度会导致在涉及屏障的密封蛋白的构象变化，从而导致增加的细胞旁通量。模仿这种效果的钙离子螯合剂乙二醇 – 双（β-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA），使用已知的有代表性的胃肠道的细胞单层。不同的方法来检测组织屏障的破坏已经存在，如免疫荧光和透气性测定法。然而，这些方法是耗时且昂贵的，不适合于动态或高通量测量。电子方法测量阻挡薄纸完整性也为跨上皮电阻（TER）的测量存在，但是这些经常是昂贵的和复杂的。快速，便宜，和敏感的方法的发展迫切需要作为屏障组织的完整性是药物发现和病原体/毒素诊断的关键参数。有机电化学晶体管（OECT）集成在一起阻挡薄纸形成细胞已被证明为能够动态监测屏障组织完整性的新设备。该设备能够测量离子通量分钟变化以前所未有时间分辨率和灵敏度，实时，作为屏障组织完整性的指标。这种新方法是基于简单的装置，可以与高通量筛选应用的兼容和制造成本低。
Introduction
胃肠上皮屏障的组织，它控制着身体的不同隔室之间的分子通路的一个例子。上皮细胞是由蛋白质所提供物理屏障1对病原体和毒素复合物结合在一起细长的柱状细胞，同时允许水和维持身体所需的营养物质通过。这种选择性是由于上皮细胞的极化，从而产生两种不同的膜结构域：暴露于管腔和锚定在下层组织2,3的细胞的基底侧的细胞的顶侧。紧密连接（TJ）是存在于上皮细胞的顶端部分的蛋白质复合物，并且是一个更大，更复杂称为心尖接头4的一部分。跨越障碍组织离子流可以或者通过跨细胞（通过细胞）或通过细胞旁路（两个相邻小区之间的）途径去。的总和通过两条途径的传输被称为跨上皮电阻。顶交界负责离子和分子通过一个特定的开启和关闭功能，通过跨越障碍5,6监管。这些蛋白质复合物的功能障碍或破坏往往与疾病7-11。此外，许多肠道病原体/毒素是已知的专门针对这种复杂的，由此进入体内并导致腹泻，最有可能作为离子/水流的跨阻挡层12-14块状失调的结果。阻挡薄纸也可通过改变细胞外微环境的改变。钙粘蛋白是细胞 – 细胞粘附的关键蛋白，并参与根尖结的形成。钙是必需的钙粘蛋白的正确构象的结构，并且在细胞外钙的降低已被证明能导致细胞 – 细胞连接的破坏和随后的开口小区15间旁细胞途径。在这项研究中，EGTA（乙二醇 – 双（β-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸），一个特定的钙离子螯合剂，是用来诱导屏障组织中一个缺口，因为它有已经显示出对细胞旁一个快速和剧烈影响离子流16,17。此钙离子螯合剂被用于对Caco-2细胞线的汇合和分化的单层。中培养细胞培养物的插入，该细胞系是已知的开发在胃肠道的特性而被广泛应用于制药工业，以测试药物18,19的吸收。
方法监测屏障组织的完整性很丰富。这些方法往往光，靠已知的在心尖结20特定蛋白质的免疫荧光染色，或依赖于荧光示踪分子，通常不渗透到阻挡薄纸的定量21,22。然而，无标记的方法（ 即没有荧光团/色）是优选的，因为使用的标签可以产生伪影，并且通常会增加成本和测定时间。电气，无标记的屏障组织的监控，最近成为一个动态监测方法23。例如在电阻抗谱最近的技术进步已经允许市售扫描装置24,25，可以测量跨上皮电阻（TER），穿过细胞层中的离子电导的测定的发展。
有机电子创造了一个独特的机会，通过使用导电聚合物，可以进行电子和离子载体接口电子和生物26,27 28,29的世界。一种新的技术来检测违规使用OECT 30-32屏障组织在最近推出。该设备对现有的技术，我们进行了验证教育署，以评估使用Cellzscope屏障组织的完整性，包括使用荧光黄免疫荧光，透气性试验和阻抗谱。在所有测试的有毒化合物的情况下，OECT被发现具有相同或更好的灵敏度操作，并且具有增加的时间分辨率相比，上述技术。在该装置中，PEDOT：PSS，已被证明是稳定的和生物相容33,34的导电聚合物，用作晶体管通道的活性材料。该OECT组成上的导电聚合物通道的任一侧的漏极和源极电极。这随后被放置在与电解质，从而形成了装置的一个组成部分的接触。栅电极浸在电解液中（ 图1），而当一个正栅极电压施加于栅极，从电解质阳离子被迫进入通道，从而脱掺杂的导电聚合物，并导致在源极-漏极的变化电流。在DEVICE因此，在离子通量由于放大的晶体管微小变化极其敏感。生长在细胞培养插入一个细胞层置于所述栅极电极和所述导电聚合物通道之间。一个完整的细胞层存在下充当屏障的阳离子进入导电聚合物，因此，在一个完整的单层的存在下，漏极电流减小（ 图2：从过渡区域a到b）。在一种有毒化合物的存在下，在阻挡薄纸将逐渐失去其完整性，又让阳离子进入到聚合物膜和增加的漏电流（ 图2：区域c）所示。用这种技术，违反阻挡薄纸在由漏极电流的调制看出，对应于整个单层的磁通的调制。该设备能够测量与实时前所未有的时间分辨率和灵敏度离子通量的微小变化。这项技术西港岛线L是在毒理学作药物测试，诊断疾病或基础研究作为屏障模型可以很容易适应的领域的兴趣。这种方法也将有助于减少动物实验，因为它允许在体外模型的验证，以取代体内试验。
Protocol
Representative Results
Discussion
这种技术提供了一种新的方法将有机电化学晶体管集成与活细胞来衡量屏障组织的完整性。该技术的主要优点是快速性和灵敏度，而且该设备对于阻挡薄纸动态监测的成本低。
这种方法是用活细胞，一个关键点就是一定要使用单层，它代表一个完整的隔离层。阻挡层的参数应的细胞系的表征过程中被定义。因此，至关重要的是不破坏细胞层时，栅电极浸在电解液中对细胞层?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本文的作者没有任何竞争经济利益。
Materials
| CLEVIOS PH 1000 | HERAUS CLEVIOS | ||
| AZ9260 resin | CIPEC SPECIALITIES | ||
| Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Culture insert Millicell PET 0.4 μm Millipore | Dominique dutscher | 51705 | |
| 24-well cell culture plate BD Falcon | Dominique dutscher | 51705 | |
| STERICUP-GP PES 0.22 μM | Dominique dutscher | 51246 | |
| ADVANCED DMEM Marque GIBCO | Fisher scientific | E3434T | |
| FBS HEAT INACT. S.AMERICAN | Fisher scientific | E3387M | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Fisher scientific | E3470C | |
| GLUTAMAX | Fisher scientific | E3524T | |
| TRYPSIN 0.05% EDTA | Fisher scientific | E3513N | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| ETHYLENE GLYCOL, ANHYDROUS, 99.8%, | Sigma aldrich | ||
| Caco-2 cells | ATCC | ||
| PDMS | Dow corning | SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER | |
| Au (99.99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Chromium (99.95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Specialty Coating Systems | ||
| Ag/AgCl wire | HARVARD APPARATUS | ||
| Photoresist | CIPEC SPECIALITIES | Résine AZ9260 |
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