يمكن اتباعها لتطوير الزرد خلال الأيام مع المجهري ورقة الضوء عندما يتم تضمين الأجنة في أنابيب البوليمر واضحة بصريا مع منخفضة التركيز الاغاروز.
المجهر الضوئي ورقة هي تقنية التصوير المثالي لدراسة التطور الجنيني الزرد. بسبب الحد الأدنى الصور سمية والتبييض، ويناسب ذلك وخاصة على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير على مدى ساعات طويلة تصل إلى عدة أيام. ومع ذلك، هناك حاجة إلى استراتيجية مناسبة تركيب العينة أن يقدم كل من الولادة والتطور الطبيعي للعينة. متعدد الطبقات المتزايدة، وهي تقنية جديدة باستخدام التضمين المنخفضة تركيز الاغاروز في أنابيب واضحة بصريا، ويتغلب الآن هذا القيد وتطلق العنان لكامل إمكانات المجهر ضوء ورقة في الوقت الحقيقي البيولوجيا التطورية.
لفهم الأحداث والتفاعلات المعقدة خلال مرحلة التطور الجنيني، والبحوث في البيولوجيا التطورية هو المزيد والمزيد من التحرك من المجهري للخلايا وحيدة وأجهزة لفي الجسم الحي التصوير من الكائنات بأكملها. تفشل تقنيات الفحص المجهري التقليدية عادة لتقديم القرار المكانية والزمانية لمتابعة الأحداث السريعة على مدى فترة طويلة من الزمن، وغالبا ما تسبب تبيض أو التأثيرات الضوئية في العينة 1. نحن وغيرنا وجدت ورقة المجهر الضوئي (الشكل 1) أن الأسلوب المثالي لفي الجسم الحي التصوير من الزرد 2-4. إضاءة العينة مع ورقة رقيقة من ضوء الليزر، ومتعامد على محور الكشف، ويقدم باجتزاء بصري سريع لقرار مكانية عالية وكذلك التقليل من الصور سمية 5. في نفس الوقت، ونتيجة لهذا الترتيب بصرية فريدة من نوعها، وتقنيات التركيب عينة التقليدية باستخدام أطباق بتري أو دوائر الثقافة ليست مناسبة. في ضوء نموذجيالمجهر رقة ثلاثة محركات متعدية ومحرك التناوب عقد العينة، بحيث يمكن وضعه على وجه التحديد، وتحولت وينظر إليها من أي اتجاه. في العينات للفحص المجهري ورقة الماضي الضوء وغالبا ما كان جزءا لا يتجزأ من 1-2٪ الاغاروز داخل الزجاج الشعرية 6،7. في هذه الحالة هو مقذوف الاسطوانة الاغاروز طدت مع العينة جزءا لا يتجزأ من الزجاج الشعرية في حجرة العينة مليئة المتوسطة مثل الماء للتصوير. الاغاروز لديها معامل الانكسار على مقربة من المياه وبالتالي فهي مناسبة تماما لفي الجسم الحي المجهري ورقة الخفيفة التي يسهل الإضاءة والكشف البصريات تصحيح الماء. يقتصر العينة في الاغاروز جامدة ويمكن تصويرها بشكل جيد لفترة قصيرة من الوقت، ولكن يعانون من ضعف بشدة التغييرات التخلق ونمو الجنين عند التصوير لعدة ساعات 7،8. على الرغم من حلول لتطبيقات أخرى تم تطويرها 9، وموسع على المدى الطويل الوقت الفاصل بين الزرد إمكانية التصوير المجهري ورقة ضوء لا يمكن استغلالها باستخدام التقليدية 1.5٪ الاغاروز التضمين.
لذا قمنا بتطوير استراتيجية جديدة للتصاعد في الجسم الحي المجهري ورقة ضوء الأجنة الزرد 10. هي التي شنت العينة في 0.1٪ الاغاروز مع 200 ملغم / لتر تريكين داخل أنبوب مصنوع من البوليمر واضحة بصريا المفلورة الإثيلين البروبيلين (محطة إثراء الوقود). الجنين جزءا لا يتجزأ من تطور عادة بسبب اللزوجة المنخفضة من المتوسط. في نفس الوقت، وأنبوب محطة إثراء الوقود يحصر المتوسطة وعينة لمدة التجربة. ونحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لتقنية جديدة وتركيب البيانات الحالية تعكس مزاياه عبر بروتوكول التقليدية. علينا أن نبرهن أنه مع أسلوبنا التنمية الزرد يمكن تصويرها بشكل مستمر مع القرار المكانية والزمانية عالية على مدى فترة من أكثر من يومين.
5IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg "/>
الشكل 1. مبدأ المجهر رقة الخفيفة. يمكن ترجمتها A الزرد شنت في أنبوب مصنوع من الإيثيلين البروبيلين المفلورة (محطة إثراء الوقود) واستدارة من خلال البؤري للهدف الكشف. ومن المتوقع ورقة رقيقة من ضوء الليزر (ورقة الضوء) عن طريق الهدف الإضاءة في المستوى البؤري للهدف الكشف وينير سوى جزء البصرية رقيقة من العينة. يتم جمع إشارة مضان المنبعثة من الهدف كشف وتسجيلها على شريحة الكاميرا.
تقنيات الفحص المجهري المتقدمة مثل المجهر ورقة ضوء تمكننا من تسجيل بيانات الصورة مع القرار الزماني والمكاني عالية على مدى عدة أيام، ولكن أيضا تتطلب تقنيات تركيب العينة إلى تحسين. نقدم بروتوكول مفصلة من متعدد الطبقات المتزايدة للفحص المجهري ورقة ضوء التطور الزرد. طريقة واضحة لتنفيذ ونستخدمها في مختبرنا على أساس يومي.
أنابيب FEP
المكونات الأساسية لاستراتيجيتنا هي تركيب أنابيب مصنوعة من الإيثيلين البروبيلين البوليمر المفلورة (محطة إثراء الوقود). قررنا استخدام محطة إثراء الوقود في المقام الأول بسبب معامل الانكسار لها من 1.338، والذي يشبه إلى المياه وبالتالي فهي مناسبة بشكل مثالي للفحص المجهري ورقة خفيفة مع أهداف المياه وغمس العينة التي تتطلب الوسط المائي. الأنابيب مع 0.8 ملم وقطرها الداخلي 0.4 مم سماكة الجدار تناسب الزرد النامية بشكل جيد للغاية، ويمكن استخدامها مع أصحاب عينة نموذجية مناسبة لل1.6 مم والشعيرات الدموية هي خيارنا الاول لطريقة عرض في تصاعد مستمر. نحن اختبار لهم بدقة في منطقتنا الاجهزة المدمج المنزل وكذلك في النظام التجاري "Lightsheet Z.1" من قبل كارل زايس المجهر وجدت أن أنابيب FEP توفر الاستقرار على المدى الطويل، لها تأثير ضئيل فقط على الأداء البصري وnonfluorescent هي 10. و، ومع ذلك، فإنها لا تتناسب مع عينات للتطبيقات التي تتطلب معامل الانكسار مختلفة، مثل مسح العينة.
تتوفر أنابيب فضلا عن رقائق مصنوعة من محطة إثراء الوقود في مجموعة متنوعة من أقطار وسمك. بالإضافة إلى ذلك، محطة إثراء الوقود يمكن ذاب في 260 درجة مئوية، وبالتالي تقدم احتمالات لا نهاية لها تقريبا لعينة الدعم حسب الطلب في تصاعد مستمر. أنابيب البوليمر تميل إلى أن يتم توفير غير المعقمة، وهذا هو السبب يتضمن البروتوكول تنظيف عدة خطوات لضمان أفضل جودة البصرية. طلاء مع ميثيل يضمن أن أي جزء من الجنين الزرد المتزايد تتمسك البوليمر.
<p clالحمار = "jove_step"> والمتوسطة المتزايدةويستند القرار ل0.1٪ الاغاروز على اختبارات مكثفة من معدل النمو والجمود في تركيزات مختلفة من الاغاروز وميثيل 10. تركيزات الاغاروز أعلاه 0.1٪ وأظهرت بالفعل تأثير شديد على معدل نمو 24 HPF الزرد. بالإضافة إلى ذلك نستخدم جرعات منخفضة من تريكين المخدرات التخدير. إمكانات كتل تريكين العمل، مما يحول دون نقل الإشارات بين الدماغ والعضلات ويمنع تقلصات العضلات 16. A تركيز 133-200 ملغم / لتر يضمن تجميد كافية من الزرد بين 24-72 HPF. ومع ذلك، تريكين والمخدرات التخدير أخرى اختبرنا جرعة تظهر الآثار الجانبية تعتمد مثل الوذمة القلبية. بالإضافة إلى الجرعة المطلوبة من تريكين يختلف مع المرحلة التنموية للجنين. لذا نوصي الحد من تركيز تريكين إلى المبلغ اللازم للمراحل التنموية التي يتم تصويرها. لضمان أفضل الاداءم، ومنع تشكيل السامة والمنتجات، وينبغي أن تستخدم محلول المخزون تريكين الطازجة أو مطلق، محمية من الضوء وليس يسخن فوق 30 درجة مئوية.
التضمين في أنابيب FEP يسمح أيضا للتعديل من السهل المتوسطة المتزايدة لحساب احتياجات محددة. للالوقت الفاصل بين التصوير من القلب، ونحن نوصي باستخدام 3٪ ميثيل و 100 ملغم / لتر تريكين بدلا من 0.1٪ الاغاروز و 200 ملغم / لتر للتركيب. ميثيل هو أكثر لزوجة من 0.1٪ الاغاروز وبالتالي توفير أعلى الجمود من تلقاء نفسه ويحتاج إلى أقل تريكين استخدامها لضمان الحبس من الجنين.
تريكين حساس لدرجات حرارة تتجاوز 30 درجة مئوية، ويمكن أيضا أن تضعف من المتوسطة في غرفة التصوير، مما يؤدي إلى انخفاض الأداء والوخز ممكن من الجنين. لذلك، تأكد من استخدام تريكين أيضا في التصوير المتوسطة التي تغمر العينة التي شنت. إذا تجاربك تتطلب استخدام أعلىدرجات الحرارة، نوصي تبادل المتوسطة في غرفة التصوير إما باستمرار باستخدام نظام نضح أو يدويا مع أنبوب والمحاقن بين اثنين من نقاط الوقت.
الخطوات الحاسمة
الخطوات الحاسمة خلال عملية تركيب العينة هي كمية من العينة في أنبوب والإدراج من المكونات الاغاروز. يحدد كمية الموقف المبدئي للجنين، والتي هي مرهقة للتغيير بعد ذلك. يجب أن تكون العينات المتعددة المتاحة لتركيب وينبغي رصد نوعية تصاعد مع stereomicroscope. إذا كان التوجه عينة ليست مرضية، وتغيير سرعة وضع العينة وتجنب الحركات اللاحقة من المكبس قد تساعد في كثير من الأحيان وهذا يلوي الجنين. الاغاروز المكونات 1.5٪ ضروري لتجنب تسرب من الاغاروز 0.1٪. يجب أن يكون سطح المكونات داخل الأنبوب شقة لعدم التأثير على التوجه عينة خلال التنمية. لتحقيق الأمواج جيدةالآس، سمك طبقات مختلفة من الاغاروز تحتاج لفحصها ويحتاج الأنبوب ليتم وضعه في الاغاروز العادي إلى السطح. الدورية للأنبوب قليلا وسحب الأنبوب النشرات بعناية المكونات من الطبق. يجب فحص جودة التركيب مع stereomicroscope قبل التصوير.
التصوير Multiview
واحدة ميزة كبيرة من ورقة المجهر ضوء التصوير multiview، والقدرة على تدوير العينة، واكتساب ض أكوام من زوايا متعددة، وبعد ذلك تسجيل وتلتحم بها. طريقة أنشئت لتسجيل ض مداخن في الفضاء 3D هو تسجيل القائم على حبة باستخدام الخرز الفلورسنت المحيطة العينة كعلامات الائتمانية 17. ولكن هذه الطريقة تعتمد على وسيط الصلبة تصاعد مثل 1.5٪ الاغاروز وبالتالي يبدو لتكون متوافقة مع تصاعد متعدد الطبقات المقدمة هنا. ولكن العديد من الحلول البديلة تعمل بالاعتماد على التطبيق. أولا، يمكن للالخرز الفلورسنتأن تدمج المكونات الاغاروز، والتي يجب أن تكون في مجال الرؤية أثناء عملية الاستحواذ. الثانية، مواقف مرحلة يمكن معايرة قبل التجارب الفعلية باستخدام 1.5٪ العمود الاغاروز مع حبات الفلورسنت. الثالث، علامات بديلة مثل نوى الفلورسنت يمكن استخدامها لتحديد موقف ض مداخن بالنسبة لبعضها البعض.
تبخر
نموذجية الاجهزة المجهري ورقة ضوء استخدام حجرة العينة المفتوحة، الأمر الذي يؤدي إلى تبخر لا مفر منه على المدى المتوسط. منذ المتوسط هو ضروري لبقاء العينة، لتقييد تبخر المتوسطة المتزايدة ومعامل الانكسار الصحيح بين البصريات وعينة، ونحن نوصي اتخاذ واحد أو أكثر من التدابير التالية لمنع التبخر. الأولى، والمتوسطة في غرفة يمكن تبادلها باستمرار من قبل نظام الارواء. الثانية، والمتوسطة يمكن تعبئتها يدويا. ثالثا، يمكن تغطيتها الغرفة مع غطاء أو رقائق مرنة.
<pالطبقة = "jove_step"> امدادات الاوكسجينتم تطوير محطة إثراء الوقود البوليمر على تحمل مجموعة كبيرة ومتنوعة من المواد الكيميائية وبالتالي فهي قوية، خامل كيميائيا وnonpermeable إلى الغاز. في حالة تصاعد الأكسجين متعدد الطبقات يمكن ان تخترق إلا من خلال المكونات الاغاروز واجهة الاغاروز الهواء، ولكن يبقى أن يظهر إذا امدادات الاوكسجين في تركيب متعدد الطبقات أقل بشدة بالمقارنة مع 1.5٪ في تصاعد الاغاروز دون دعم أنبوب البوليمر. لكن، وكما تصاعد في 1.5٪ الاغاروز يمكن أن تستخدم إلا لمدة ساعتين تقريبا قبل يتأثر التشكل الزرد متعدد الطبقات تصاعد يبدو أن الحل الشامل للتصوير متفوقة على المدى الطويل.
تصوير المراحل الأولى من التطوير
متعدد الطبقات المتزايدة أصبح الآن لدينا تقنية التضمين القياسية للفحص المجهري ورقة ضوء الوقت الفاصل بين الزرد الأكبر سنا من 24 HPF. وبالاضافة الى ذلك، ونحن أيضا استخدام أنابيب البوليمر لتصوير الأجنة مرحلة مبكرة. البريدتبقى mbryos في chorions وتقام في أنبوب محطة إثراء الوقود مع القطر الداخلي من 1 ملم ومليئة E3. الزرد يمكن أن تتطور بحرية داخل المشيماء ومازال يمكن تصويرها بشكل جيد باستخدام المجهر رقة الخفيفة.
توقعات
وقدم عينة متعدد الطبقات تصاعد تطلق العنان لكامل إمكانات المجهر ضوء ورقة في الوقت الحقيقي البيولوجيا التطورية مع الزرد. يمكن بسهولة أن يتم اعتمادها لتقنيات الفحص المجهري أخرى مثل التصوير المقطعي البصري الإسقاط (الأراضي الفلسطينية المحتلة) والكائنات الحية الأخرى. ونحن نعتقد أن محطة إثراء الوقود أنابيب من الحجم العادي ليست سوى الخطوات الأولى نحو تقنيات التركيب عينة مصممة خصيصا لتلبية الاحتياجات المحددة.
The authors have nothing to disclose.
نشكر جمعية ماكس بلانك، وبرنامج العلوم الحدودي الإنسان (HFSP) وبورنغير إنغلهايم فون للتمويل والدعم.
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes | Bola | S 1815-04 | 0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available |
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe | B. Braun Melsungen AG | 9161406 V | |
Sterican Single-Use Cannula, blunt | B. Braun Melsungen AG | 9180109 | 0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube |
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
1 M NaOH | |||
0.5 M NaOH | |||
70% EtOH | |||
Methylcellulose | Sigma | M0387 | supplied as powder |
E3 medium (for zebrafish embryos) | |||
1.5 ml Reaction Tube | Eppendorf | 3810X | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414 | supplied as powder |
Petri Dish | Greiner | 633180 | plastic, 94 x 16 mm |
Tricaine | Sigma | E10521 | synonyms: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate |
10x/0.3 W Microscope Objective Lens | Leica | HCX APO L | |
EMCCD Camera | Andor Technology | iXon 885 EMCCD |