O desenvolvimento do peixe-zebra pode ser seguido ao longo de dias com microscopia folha de luz quando os embriões estão embutidos em tubos de polímero opticamente clara com agarose de baixa concentração.
Microscopia folha de luz é a técnica de imagem ideal para estudar o desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Devido à foto-toxicidade e branqueamento mínimo, que é particularmente adequado para a longo prazo de imagens de lapso de tempo ao longo de muitas horas até vários dias. No entanto, uma estratégia adequada de montagem de amostra é necessário que oferece tanto confinamento e desenvolvimento normal da amostra. Multilayer da montagem, uma nova técnica de incorporação usando agarose de baixa concentração em tubos opticamente clara, agora supera esta limitação e desencadeia o potencial de microscopia folha de luz para a biologia do desenvolvimento em tempo real.
Para entender os eventos complexos e interações durante a embriogênese, a pesquisa em biologia do desenvolvimento é cada vez mais se deslocam de microscopia de células e órgãos individuais a imagem in vivo de organismos inteiros. As técnicas tradicionais de microscopia geralmente não oferecem a resolução espacial e temporal para acompanhar os acontecimentos rápidos ao longo de um longo período de tempo e muitas vezes causam efeitos de branqueamento ou phototoxic na amostra 1. Nós e outros encontrados microscopia folha de luz (Figura 1) para ser a técnica ideal para imagem in vivo de peixe-zebra 2-4. A iluminação da amostra, com uma folha fina de luz laser, ortogonal ao eixo de detecção, oferece corte óptico rápido com alta resolução espacial, bem como foto-toxicidade minimizado 5. Ao mesmo tempo, devido a esta disposição óptica única, as técnicas de montagem de amostra tradicionais usando pratos de Petri ou câmaras de cultura não são adequados. Em uma luz típicafolha microscópio três motores de translação e de rotação de um motor de manter a amostra, de tal modo que ele pode ser posicionado com precisão, virou-se e visto a partir de qualquer direcção. Nos últimos espécimes para microscopia folha de luz, muitas vezes têm sido incorporados em 1-2% agarose dentro de um capilar de vidro 6,7. Neste caso, o cilindro de agarose solidificada com o espécime embutidos é extrudido para fora do capilar de vidro para a câmara de amostra preenchida com meio, como a água para a imagiologia. Agarose tem um índice de refração próximo à água e é, portanto, perfeitamente adequado para in vivo microscopia folha de luz que facilita a iluminação e detecção óptica corrigida pela água. A amostra é confinado na agarose rígida e pode ser trabalhada bem durante um curto período de tempo, mas as alterações morfogenéticas e crescimento do embrião são fortemente prejudicada na obtenção de imagens por várias horas 7,8. Embora as soluções para outras aplicações foram desenvolvidas 9, a não-invasiva a longo prazo zebrafish time-lapse potencial de imagem de microscopia folha de luz não pode ser explorada usando o 1,5% de agarose incorporação convencional.
Por isso, desenvolvemos uma nova estratégia para a montagem in vivo microscopia folha de luz de embriões de peixes-zebra 10. A amostra é montada nas 0,1% de agarose com 200 mg / L tricaina dentro de um tubo feito de polímero fluorado de Etileno Propileno opticamente clara (FEP). O embrião se desenvolve normalmente incorporado devido à baixa viscosidade do meio. Ao mesmo tempo, o tubo FEP confina a médio e a amostra para a duração da experiência. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado da nova técnica de montagem e apresentar dados que reflete suas vantagens sobre o protocolo convencional. Nós demonstramos que o nosso método de desenvolvimento do peixe-zebra pode ser continuamente trabalhada com uma elevada resolução espacial e temporal, durante um período de mais do que dois dias.
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Figura 1. O princípio da folha microscopia de luz. Um peixe-zebra montado num tubo feito de etileno-propileno fluoretizado (FEP), podem ser traduzidos e rodado através do plano focal da objectiva de detecção. Uma folha fina de luz laser (folha de luz) é projetada pelo objectivo de iluminação para o plano focal da objetiva detecção e ilumina apenas uma secção óptica fina do espécime. O sinal de fluorescência emitida é recolhida pelo objectivo de detecção e gravados num chip de câmara.
Técnicas avançadas de microscopia, como a microscopia folha de luz nos permitem gravar dados de imagem com alta resolução temporal e espacial ao longo de vários dias, mas também exigem técnicas de montagem de amostras para melhorar. Nós apresentamos um protocolo detalhado de montagem para microscopia folha de luz do desenvolvimento do peixe-zebra multicamadas. O método é simples de implementar e podemos usá-lo em nosso laboratório em uma base diária.
Os tubos de FEP
Os principais componentes de nossa estratégia de montagem são tubos feitos de polímero de etileno propileno fluorado (FEP). Decidimos usar FEP principalmente por causa de seu índice de refração de 1,338, que é semelhante à água e, portanto, ideal para microscopia folha de luz com os objetivos de água de imersão e os espécimes que necessitam de meios aquosos. Os tubos, com 0,8 mm de diâmetro interno e 0,4 mm de espessura de parede encaixam o desenvolvimento do peixe-zebra muito bem, pode ser usado com os suportes de amostras típicas adequadas para 1,6 milímetroscapilares e são a primeira opção para o método de montagem apresentada. Nós testamos-los completamente em nossas instalações construídos em casa, bem como no sistema comercial "Lightsheet Z.1" por Carl Zeiss Microscopy e descobriu que os tubos de FEP oferecer estabilidade a longo prazo, têm apenas um impacto mínimo no desempenho óptico e não fluorescente são 10. Eles são, no entanto, não é adequado para aplicações com amostras que requerem um índice de refracção diferente, por exemplo, afastada espécime.
Os tubos, assim como películas feitas de FEP estão disponíveis numa variedade de diâmetros e espessuras. Além disso, o FEP pode ser derretido a 260 ° C e, portanto, oferece possibilidades quase infinitas para suportes de montagem de amostras feitos sob medida. Os tubos de polímeros tendem a ser fornecido não estéril, razão pela qual o protocolo de limpeza incorpora várias medidas para assegurar a melhor qualidade óptica. O revestimento com metilcelulose assegura que nenhuma parte do crescimento de embriões de peixe-zebra adere ao polímero.
<p class = "jove_step"> O meio de montagemA decisão para 0,1% de agarose baseia-se extensos testes de taxa de crescimento e de imobilidade em diferentes concentrações de agarose e metil-celulose 10. Concentrações de agarose 0,1% acima já mostrou um grave impacto sobre a taxa de crescimento de 24 hpf peixe-zebra. Além disso, usamos baixas doses da droga tricaina anestesiante. Potenciais blocos tricaina de ação, portanto, inibe a transmissão de sinais entre o cérebro e os músculos e suprime as contrações musculares 16. Uma concentração de 133-200 mg / L garante a imobilização suficiente de peixe-zebra 24-72 hpf. No entanto, tricaina e outras drogas anestesia de nós testamos show de efeitos colaterais de doses dependentes, tais como edema cardíaco. Além disso, a dose necessária de tricaina varia de acordo com o estádio de desenvolvimento do embrião. Recomendamos, portanto, reduzindo a concentração tricaina ao montante necessário para as fases de desenvolvimento que têm imagem. Para garantir a melhor performance e evitar a formação de subprodutos tóxicos, deve ser utilizado de solução stock recém-preparada ou descongelado tricaina, protegido da luz e não aquecida acima de 30 ° C.
A incorporação em tubos de FEP também permite a fácil modificação do meio de montagem para contabilizar as necessidades específicas. Por lapso de tempo de imagem do coração, recomendamos o uso de 3% de metilcelulose e 100 mg / L tricaina em vez de 0,1% de agarose e 200 mg / L para a montagem. A metilcelulose é mais viscoso do que 0,1% de agarose proporcionando assim maior imobilidade no seu próprio e menos tricaina precisa de ser usado para assegurar o confinamento do embrião.
Tricaina é sensível a temperaturas acima de 30 ° C, e também pode ser diluído com o meio na câmara de imagem, o que leva a uma diminuição do desempenho e possível espasmos do embrião. Portanto, certifique-se de usar tricaina também no meio de imagem em que o espécime montado está imerso. Se seus experimentos requerem o uso de maiortemperaturas, recomendamos a troca do meio na câmara de imagem seja constantemente por meio de um sistema de perfusão, ou manualmente, com um tubo e uma seringa entre dois pontos de tempo.
As etapas críticas
Os passos críticos durante o processo de montagem da amostra são a ingestão do espécime para dentro do tubo e a inserção do tampão de agarose. A ingestão define a posição inicial do embrião, o que é incómodo para mudar depois. Várias amostras devem estar disponíveis para a montagem ea qualidade de montagem deve ser monitorizada com um microscópio estereoscópico. Se a orientação da amostra não é satisfatório, alterando a velocidade de elaboração da amostra e evitando movimentos subsequentes do êmbolo pode ajudar como isso muitas vezes torce o embrião. A ficha de agarose a 1,5% é necessário para evitar a fuga de agarose 0,1%. A superfície do tampão no interior do tubo deve ser plana para não influenciar a orientação da amostra durante o desenvolvimento. Para conseguir um bom surfeás, diferentes espessuras das camadas de agarose precisa ser testado e o tubo precisa de ser colocado na agarose normal à superfície. Girar o tubo um pouco e puxar o tubo libera cuidadosamente a ficha do prato. A qualidade da montagem deve ser verificada com um microscópio estereoscópico antes de imagem.
Imaging Multiview
Uma grande vantagem da microscopia folha de luz é a imagem multiview, a capacidade de girar a amostra, adquirir z-stacks de múltiplos ângulos e, posteriormente, registrar e fundi-las. Um método criado para registrar os z-stacks no espaço 3D é o registro baseado em talão usando partículas fluorescentes em torno da amostra como marcadores fiduciários 17. Este método, porém, depende de um meio de montagem sólida como 1,5% de agarose e, portanto, parece ser incompatível com a multicamada montagem aqui apresentada. Mas várias soluções alternativas funcionar, dependendo da aplicação. Em primeiro lugar, as pérolas fluorescentes podeser incorporado no tampão de agarose, o qual tem de ser, no campo de visão durante a aquisição. Em segundo lugar, as posições de fase pode ser calibrado antes das experiências reais, utilizando uma coluna de agarose a 1,5% com partículas fluorescentes. Em terceiro lugar, marcadores alternativos, tais como os núcleos fluorescentes pode ser utilizada para identificar a posição das pilhas z em relação ao outro.
Evaporação
Típicas configurações de microscopia folha de luz usar uma câmara de amostra aberto, o que leva inevitavelmente à evaporação do meio. Uma vez que o meio é essencial para a sobrevivência da amostra, para limitar a evaporação do meio de montagem e para o índice de refração correcto entre a óptica e da amostra, é recomendável tendo uma ou mais das seguintes medidas para evitar a evaporação. Em primeiro lugar, o meio na câmara possa ser sempre trocados por um sistema de perfusão. Em segundo lugar, o meio pode ser recarregado manualmente. Em terceiro lugar, a câmara pode ser coberta com uma tampa ou uma película flexível.
<pclass = "jove_step"> fornecimento de oxigênioO polímero de FEP foi desenvolvida para resistir a uma grande variedade de produtos químicos e é, portanto, robusto, quimicamente inerte e não permeável a gases. No caso da montagem de múltiplas camadas de oxigênio só pode penetrar através da ficha de agarose ea interface de agarose a ar, mas continua a ser apresentado, se o suprimento de oxigênio na montagem de múltiplas camadas é severamente menor quando comparado ao de montagem em 1,5% de agarose, sem apoio tubo de polímero. No entanto, tal como montagem em agarose a 1,5% só pode ser utilizada durante cerca de duas horas antes da morfologia do peixe-zebra é afectada montagem multicamadas parece ser a solução superior geral para geração de imagens de longo prazo.
Imagiologia estágios iniciais de desenvolvimento
Multilayer montagem tornou-se agora a nossa técnica de incorporação padrão para microscopia folha de luz lapso de tempo de peixe-zebra com mais de 24 hpf. Além disso, também usamos os tubos de polímero para imagens de embriões em estágio anteriores. O embryos permanecem nas suas córions e são montados num tubo FEP com um diâmetro interior de 1 mm e cheio com E3. O peixe-zebra pode desenvolver livremente dentro do córion e ainda pode ser trabalhada também por microscopia folha de luz.
Perspectiva
A montagem da amostra multicamadas apresentado desencadeia o potencial de microscopia folha de luz para a biologia do desenvolvimento em tempo real com peixes-zebra. Ele pode ser facilmente adoptado para outras técnicas de microscopia, tais como a tomografia óptica de projecção (OPT) e outros organismos. Acreditamos que os tubos de FEP tamanho padrão são apenas os primeiros passos para técnicas de montagem da amostra sob medida para necessidades específicas.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Sociedade Max Planck, o Human Frontier Science Program (HFSP) eo Boehringer Ingelheim Fonds para financiamento e apoio.
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes | Bola | S 1815-04 | 0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available |
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe | B. Braun Melsungen AG | 9161406 V | |
Sterican Single-Use Cannula, blunt | B. Braun Melsungen AG | 9180109 | 0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube |
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
1 M NaOH | |||
0.5 M NaOH | |||
70% EtOH | |||
Methylcellulose | Sigma | M0387 | supplied as powder |
E3 medium (for zebrafish embryos) | |||
1.5 ml Reaction Tube | Eppendorf | 3810X | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414 | supplied as powder |
Petri Dish | Greiner | 633180 | plastic, 94 x 16 mm |
Tricaine | Sigma | E10521 | synonyms: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate |
10x/0.3 W Microscope Objective Lens | Leica | HCX APO L | |
EMCCD Camera | Andor Technology | iXon 885 EMCCD |