Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Summary

Haute résolution intravitale imagerie avec un contraste accru jusqu'à 120 um de profondeur dans les ganglions lymphatiques de la souris adulte est obtenue en modulant spatialement le modèle d'excitation d'un multi-focal microscope à deux photons. En 100 profondeur pm nous avons mesuré des résolutions de 487 nm (latéraux) et 551 nm (axial), contournant ainsi les limites de diffusion et de diffraction.

Abstract

Suivi communication cellulaire par intravitale profond des tissus multi-microscopie biphotonique est la clé pour comprendre le destin des cellules immunitaires dans les échantillons de tissus et d'organes d'épaisseur dans la santé et la maladie. En contrôlant le motif de balayage dans la microscopie multi-photons et en appliquant des algorithmes numériques appropriés, nous avons développé une approche rayé-illumination, ce qui nous a permis d'atteindre trois fois meilleure résolution axiale et une amélioration de rapport signal sur bruit, c'est à dire l'inverse, en plus de profondeur de 100 um de tissu dans le tissu des organes lymphoïdes haute diffusion par rapport à la microscopie multi-photons standard. La vitesse d'acquisition ainsi que photoblanchiment et le photovieillissement effets sont similaires à la technique à base de photo-multiplicateur-standard, tandis que la profondeur d'imagerie a été légèrement inférieure en raison de l'utilisation de détecteurs de champ. En utilisant l'approche-éclairage rayé, nous sommes en mesure d'observer la dynamique des dépôts de complexes immuns sur les cellules dendritiques folliculaires secondaires ̵1; au niveau de quelques molécules de protéines dans les centres germinatifs.

Introduction

Deux photons laser microscopie (TPLSM), avec ses avantages pour l'imagerie des tissus profonds liés à infrarouge ultra-courte excitation pulsée ^1, a révolutionné notre point de vue sur les processus vitaux sur un seul niveau cellulaire en révélant la motilité et l'interaction de divers modèles sous-ensembles de cellules dans des animaux vivants ^5.2. Cependant, la technologie actuelle est encore insuffisant pour élucider les mécanismes de fonctionnement des organes et le dysfonctionnement comme une condition préalable pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, car il ne rend rares informations sur les bases moléculaires de la réponse cellulaire dans les tissus de la santé et de la maladie. La technologie actuelle permet seulement une fenêtre spatiale de quelques centaines de microns en raison de la dispersion des vagues et des effets de distorsion de front sur ​​la résolution spatiale et rapport signal à bruit ^{de 6,} ce qui est particulièrement évident dans le tissu très compact d'animaux adultes. Ces vagues de diffusion et des effets de distorsion avant sont dues à une une très hétérogènesd la distribution anisotrope de l'indice de réfraction dans le tissu, ce qui conduit dans une première étape à une dégradation de la résolution spatiale dépend de la profondeur en 3D, et enfin à la perte totale du signal provenant de photons d'excitation balistiques, à savoir la perte de rapport signal à bruit. En termes de bioscientifiques et les applications biomédicales des tissus profonds, cela signifie que la technologie actuelle n'est pas en mesure de révéler sans équivoque communication cellulaire parce que la mauvaise résolution entraîner des interactions faussement positifs alors que la diminution de rapport signal-sur-bruit causerait le système de négliger certains interactions entre les structures sombres.

Afin de détecter sans équivoque interactions cellulaires de façon dynamique, une résolution spatiale très améliorée est nécessaire profond dans le tissu. Les techniques de nanoscopie puissants actuellement introduites sur la base d'algorithmes numériques spéciaux, par exemple des approches structure éclairage, sur l'épuisement du premier état ​​excité, par exemple </em> STED, RESOLFT, ou sur la localisation molécule, par exemple dSTORM, PALM, ont trouvé de nombreuses applications dans les cellules fixes ainsi que dans des cultures de cellules vivantes ^7. Toutefois, afin d'étendre ces applications à des coupes de tissus, des tissus vivants et organismes que nous avons encore besoin de surmonter les difficultés techniques graves. Excitation à deux photons STED avec différentes longueurs d'onde, ainsi que d'une seule longueur d'onde (sw2PE-STED) pour l'excitation et l'émission stimulée a été appliquée pour améliorer la résolution latérale dans des tranches de cerveau ⁸ ou dans des matrices artificielles à cellules incluses ^9, respectivement, dans le même résolution axiale comme TPLSM standard. Utilisation d'un photon STED, la dynamique des épines dendritiques peuvent être imagées à la surface du cortex cérébral (jusqu'à 10 à 15 um de profondeur) dans une souris vivante Thy1 EGFP à une résolution de 67 nm ^10. Un outil polyvalent pour la biologie du développement est fourni par la microscopie structuré-éclairage multifocale, qui fournit deux fois améliorée 2Drésolution. Cependant, cette technique peut être utilisée que dans les organismes avec une faible propension de diffusion de la lumière tels que des embryons de poisson zèbre ^11. Cependant, aucune de ces techniques peut être appliquée dans le tissu très diffusant des animaux adultes à plusieurs centaines de micromètres, qui sont cruciales pour les modèles de la recherche biomédicale et clinique des maladies avec la survenue après la naissance.

Indépendant de l'approximation utilisée pour calculer la forme de l'avant onde limitée par la diffraction, c'est à dire la fonction d'étalement de point (PSF), après focalisation par une lentille, la largeur de la PSF long de l'axe optique (résolution axiale) est au moins trois fois plus grande que la largeur de la PSF perpendiculaire à l'axe optique (résolution latérale) ^12. Déformations de l'onde avant d'ordres différents quantifiés par les coefficients de Zernike modifier considérablement la forme du front d'onde de l'onde électromagnétique concentré dans l'imagerie des tissus profonds menant à beaucoup plus PSF, en particulier le long de la fibreal axe ^13-15. Par conséquent, à la fois les lois de la diffraction et les effets de distorsion de front d'onde point à la résolution le long de l'axe optique que le facteur limitant dans l'imagerie des tissus profonds. Considérant que des techniques nanoscopie concentrent sur la lutte contre les limites de la diffraction seulement, une technologie qui améliore la résolution axiale et le contraste en compensant à la fois la diffraction et les effets de distorsion de front d'onde est nécessaire pour intravitale imagerie à haute résolution. Idéalement, cette technique devrait également être suffisamment rapide pour permettre un suivi de la dynamique cellulaire.

La correction en temps réel des aberrations PSF et la perte de contraste à l'aide de l'optique adaptative dans TPLSM a été largement étudié et amélioré dans la dernière décennie ^13,14,16-18 et il est donc le meilleur choix actuellement disponibles conduisant à une meilleure gestion de l'excitation balistique photons ^14. Cependant, en raison du fait que la plupart des vagues avant correction approches utilisées en optique adaptative sont itérative et qu'ils have être répété pour les petites surfaces (quelques 10 x 10 um ²⁾ en raison de la forte hétérogénéité de l'indice de réfraction dans le tissu, la vitesse d'acquisition est significativement plus faible que nécessaire pour la motilité cellulaire et la communication d'image. En outre, la limite physique en optique adaptative améliorée TPLSM est toujours déterminée par diffraction.

Modulation spatiale de l'illumination (SPIN) et modulation temporelle sur le côté de détection (SPADE) ont été théoriquement proposé à appliquer à la microscopie à balayage laser pour améliorer la résolution. Leur application pratique dans l'imagerie intravitale reste encore à être démontrée ^19.

Dans l'ensemble, il ya une forte demande pour le développement de technologies qui améliorent la résolution pour l'imagerie des tissus profonds chez les animaux adultes vivant. Dans ce travail, nous obtenons la modulation spatiale du motif d'excitation en commandant le processus de balayage à faisceaux multiples rayé-illumination multi-photons laser-smicroscopie de la conserve (Mo-SI-MPLSM) ^20. Contrairement aux approches d'éclairage structuré, dans lequel la section d'excitation transversale du faisceau est modulé spatialement, on utilise seulement le processus de balayage pour réaliser la modulation spatiale de l'excitation. En élargissant l'excitation à une longueur d'onde plus, nous sommes en mesure d'améliorer à la fois la résolution spatiale et le rapport signal-sur-bruit dans les tissus profonds de haute diffusion tissulaire (par exemple des ganglions lymphatiques, chemin libre diffusion 47 um ^6), indépendamment de l'optique signal non-linéaire nous détectons, par exemple fluorescence, génération de second harmonique ou autre fréquence mélange phénomène. En utilisant cette approche à des longueurs d'onde d'excitation à 900 nm, nous sommes en mesure de façon dynamique l'image des structures de protéines cellulaires à l'échelle de quelques molécules dans les centres germinaux des ganglions lymphatiques de souris. Ainsi, on peut mieux visualiser l'interaction entre les unités de support d'antigène sur la surface des cellules dendritiques folliculaires et les cellules B dans le processus de palpage contre lagen au cours de la réponse immunitaire dans les organes lymphoïdes secondaires.

Protocol

Configuration multi-faisceaux pour Striped-éclairage TPLSM Le montage utilisé ici est un multi-faisceaux à deux photons laser à balayage microscope spécialisé, tel que décrit précédemment 6,20. Le système est illustré sur la figure 1. L'approche peut être appliquée à d'autres microscopes à balayage laser à deux photons, qui sont capables de synchroniser l'acquisition de la caméra avec le mouvement des miroirs de galvoscanner, même si el…

Representative Results

La résolution spatiale dans les ganglions lymphatiques Les dimensions de la fonction d'étalement de point efficace (EPSF) correspondent à la résolution spatiale d'un microscope 12. Nous avons mesuré la fonction tridimensionnelle en acquérant le signal de deuxième génération d'harmoniques de fibres de collagène dans les ganglions lymphatiques par notre MB-SI-TPLSM par rapport à l'établis des techniques de microscopie à balayage laser à deux photons, c…

Discussion

Le but de l'imagerie optique intravitale est de visualiser dynamiquement et fonctionnellement la motilité cellulaire et interactions pour comprendre le tissu et la fonction des organes en santé et la maladie ^5. La technologie la plus puissante pour ce faire, multi-photons laser microscopie, doit encore surmonter les limitations liées à la vague distorsions avant, la diffusion, l'acquisition lente, photoblanchiment et le photovieillissement, qui limitent la résolution spatiale, le contraste ainsi …

Materials

ATTO590 – NSH for coupling	ATTO Tec, Germany	AD-590-35	–
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590	DRFZ, Berlin	–	The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+	Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US	–	Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment	StemmCell Technologies, Germany	19854	–
Polystyren beads (605), 0.2 µm	Life Technologies, Germany	F8803	–
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
TriMScope I	LaVision Biotec, Bielefeld, Germany	–	–
OPO (manual version)	APE, Berlin, Germany	–	–
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II	Coherent, Duisburg, Germany	–	–
water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm	Olympus Germany, Hamburg, Germany	–	–