어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경
Summary
성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.
Abstract
의 intravital 깊은 조직 다 광자 현미경으로 세포 통신을 모니터링하는 것은 건강과 질병에있는 두꺼운 조직 샘플 및 기관 내에서 면역 세포의 운명을 이해하기위한 열쇠입니다. 다 광자 현미경의 주사 패턴을 제어하고 적절한 수치 알고리즘을 적용하여, 우리는 더 나은 축 해상도 및보다 향상된 신호대 잡음비, 즉 콘트라스트를 3 배 달성 저희 활성화하는 스트라이프 – 조명 방식을 개발 표준 다 광자 현미경에 비해 높은 림프 기관의 조직을 산란 내에서 100 μm의 조직 깊이. 촬상 깊이 인해 전계 감지기의 사용에 약간 낮았다 반면 수집 속도뿐만 아니라 광표백 광 손상 및 효과는 표준 광 곱셈기 기반의 기술과 유사했다. 스트라이프 – 조명 방식을 사용함으로써, 우리는 보조 모낭 수지상 세포에 면역 복합체 침착의 역학을 관찰 할 수있다 ̵1; 본원 센터에서 몇 가지 단백질 분자의 수준에서.
Introduction
두 광자 레이저 스캐닝 현미경 (TPLSM)는 적외선 초단 펄스 여기 1 관련 깊은 조직 이미징을위한 장점과 함께, 각종의 운동과 상호 작용 패턴을 공개하여 단일 세포 수준에서 중요한 프로세스에 대한 우리의 관점을 혁명 동물에게 2-5 살아있는 세포의 부분 집합. 그러나, 현재의 기술은 건강과 질병에있는 조직 내에서 세포 반응의 분자 기초에 대한 전용 스파 스 정보를 렌더링하기 때문에, 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전제 조건으로 장기의 기능과 장애의 메커니즘을 규명하는 것은 여전히 불충분하다. 현재의 기술은 산란에 의한 수백 미크론의 공간 만 창을 가능하게하고, 공간 해상도 및 성인 동물의 매우 컴팩트 한 조직에서 특히 명백하다 신호대 잡음비 (6), 프런트 왜곡 효과 거절. 이러한 산란 및 파면 왜곡 효과는 매우 이질적인에 기인3D 공간 해상도의 깊이 의존 열화에 대한 첫 번째 단계에서 주요한 조직의 굴절률 이방성의 디 분포, 그리고 마지막 탄도 여진 광자, 신호 대 잡음비의 손실이 예에서 발생 된 신호의 총 손실이다. bioscientific 의치 깊은 조직 애플리케이션의 관점에서, 이는 신호 대 잡음비의 감소가 시스템을 간과하는 결과가 발생하는 반면 해상 불량 거짓 양성 상호 작용을 초래할 것이기 때문에 현재의 기술이 명백하게 셀룰러 통신을 공개 할 수없는 것을 의미 희미한 구조 사이의 상호 작용.
명백하게 동적 방식으로 셀룰러 상호 작용을 검출하기 위해, 높은 공간 해상도 향상 깊은 조직 내에서 필요하다. 예 특수 수치 알고리즘 제 여기 상태의 고갈에 예를 들면 구조 조명 접근법에 기초하여 현재 도입 강력한 nanoscopy 기법 </em> STED, RESOLFT, 또는 분자 현지화에, 예를 들면 dSTORM, PALM은 고정 된 세포뿐만 아니라 라이브 세포 배양 7에서 여러 응용 프로그램을 발견했다. 그러나, 조직 섹션, 생체 조직과 유기체에 이러한 응용 프로그램을 확장하기 위해 우리는 여전히 심각한 기술적 인 어려움을 극복해야합니다. 이광자 여기에서는 서로 다른 파장으로뿐만 아니라 여기에 대한 단일 파장 (sw2PE-STED)로 STED 및 배출 동일에서 각각 매립 셀 09과 뇌 조각 8 또는 인공 매트릭스에서 측 방향 해상도를 향상시키기 위해 적용된 자극 표준 TPLSM으로 축 해상도. 하나의 광자 STED를 사용하여, 돌기 쪽의 역학은 67 내지 10 nm의 해상도에서 생활 Thy1 EGFP 마우스의 뇌 피질 (최대 15 μm의 깊이)의 표면에 이미지가 될 수있다. 발달 생물학을위한 다양한 도구를 두 배 향상 차원을 제공하는 다 초점 구조화 조명 현미경에 의해 제공됩니다해상도. 그러나,이 기술은 단지 이러한 제브라 피쉬 배아 (11)로서 광 산란 낮은 성향 유기체에서 사용될 수있다. 그러나 이러한 기술 중 어느 것도 출산 후 증상과 질병의 생물 의학 및 임상 연구에 중요한 모델입니다 마이크로 미터의 수백에서 성인 동물의 높은 산란 조직에 적용 할 수 없습니다.
점 분포 함수 (PSF), 즉 회절 한정 파면 형상을 계산하는 데 사용되는 근사 독립, 렌즈를 포커싱 한 후, 광축 (축선 방향 해상도)을 따라 PSF의 폭보다 적어도 세 배 더 크다 광축 (측 방향 해상도) (12)에 수직 인 PSF 폭. 상당히, 특히 눈을 따라 훨씬 더 큰 PSFS, 선도 깊은 조직 이미징에 초점을 맞춘 전자파의 파면 형상을 수정 니케 계수에 의해 정량화 다른 순서의 앞에 왜곡 웨이브알은 13 ~ 15 축. 따라서, 회절 법 및 파면 왜곡 효과 모두는 깊은 조직 이미징 제한 요소로서, 광축을 따라 해상도를 가리. nanoscopy 기술이 회절 한계를 반작용 초점 반면 만, 축 방향 해상도 및 회절 파면 왜곡 효과를 모두 반작용에 의해 콘트라스트를 향상시키는 기술은 고해상도의 intravital 이미징을 위해 필요하다. 이상적으로,이 기술은 충분히 빨리 세포 역학의 모니터링을 허용 할 수도 있어야한다.
PSF의 수차 및 TPLSM에 적응 광학을 사용하여 대비 손실의 실시간 보정이 광범위하게 연구 및 지난 십 13,14,16-18 개선하고 따라서 탄도 여기의 더 나은 관리에 이르는 최선의 현재의 선택을 한 14 광자. 아직도 인해 대부분의 전면 수정이 적응 광학에 사용되는 접근법 파도는 사실을 반복하고 그들이 하 것이있다인해 조직의 굴절률의 높은 이질성으로 작은 면적 (거의 없음 10 × 10 ㎛ 2)을 반복 할 적이, 수집 속도는 촬상 세포 운동성 및 통신을 위해 필요한 것보다 훨씬 낮다. 또한, 적응 광학의 물리적 한계는 TPLSM 여전히 회절에 의해 결정됩니다 향상.
조명 (SPIN) 및 검출 측 (SPADE)의 시간적 공간적으로 변조 된 변조 이론적 해상도를 향상시키기 위해 레이저 주사 현미경에 적용하는 것이 제안되어왔다. 의 intravital 영상에서의 실용적인 응용 프로그램은 여전히 19을 입증 할 수 남아 있습니다.
이와 함께, 성인 살아있는 동물의 깊은 조직 영상의 해상도 향상 기술의 개발에 대한 높은 수요가있다. 본 연구에서, 우리는 멀티 빔 스트라이프 – 조명 다중 광자 레이저들에서 스캐닝 과정을 제어함으로써, 여기 패턴의 공간 변조를 달성통조림 현미경 (MB-SI-MPLSM) 20. 여기 빔 단면이 공간적으로 변조 된 구조화 된 조명 방식, 반대로, 우리는 여기의 공간 변조를 달성하기 위해 단지 스캐닝 과정을 사용한다. 긴 파장으로 여기를 확장하여, 우리는 독립적으로 광 중에서, 높은 조직 (예, 림프절, 자유 산란 경로 47 μM 6) 비산 깊은 조직에서의 공간적 해상도 및 신호대 잡음비를 모두 향상시킬 수있다 우리가 감지 비선형 신호, 예를 들어, 형광, 두 번째 고조파 발생 또는 다른 주파수 현상을 혼합. 900 nm의 최대 여기 파장에서이 방법을 사용하여 우리는 마우스 림프절의 싹 센터에서 몇 분자의 규모에 동적으로 이미지 세포 단백질 구조 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 더 나은 항 프로빙 프로세스에 모낭 수지상 세포 및 B 세포의 표면에서 항원 운반 유닛 간의 상호 작용을 시각화 할차 림프 기관의 면역 반응 중에 세대.
Protocol
Representative Results
Discussion
의 intravital 광학 영상의 목적은 동적으로 기능적 조직과 건강과 질병 5 장기의 기능을 이해하기 위해 세포 운동성 및 상호 작용을 시각화하는 것입니다. 이러한 다중 광자 레이저 주사 현미경을 달성하기 위해 가장 강력한 기술은, 아직, 그 공간 해상도를 제한 전면 왜곡 산란 느린 취득 photobleaching에 및 광 손상을 거절 관련된 한계를 극복 대조뿐만 아니라 시간 해상도를 가지고 .
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 C57BL / 6 B1-8 GFP 형질 전환 마우스를 제공하기위한 스트라이프 – 조명 방식, K. Rajewsky 및 A. Haberman의 개발 기간 동안 유익한 토론을위한 R. Heintzmann 감사합니다. 우리는 재정 지원에 대한 독일 부여 NI1167/3-1에서 Forschungsgemeinschaft (RN에), HA5354/4-1 및 SFB633, 프로젝트 A15 (AEH에) 부여 한 Rahel – 허쉬의 교제에서 샤리 (RN에)을 인정합니다. 우리는 특히 유익한 토론과 인프라 지원을위한 네트워크 JIMI을 인정
Materials
| ATTO590 – NSH for coupling | ATTO Tec, Germany | AD-590-35 | – |
| CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 | DRFZ, Berlin | – | The coupling reaction was performed in the central lab of our institution. |
| B1-8 Jk-/- EGFP+ | Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US | – | Can be also found at Jackson Laboratories (JAX). |
| EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment | StemmCell Technologies, Germany | 19854 | – |
| Polystyren beads (605), 0.2 µm | Life Technologies, Germany | F8803 | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TriMScope I | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | – | – |
| OPO (manual version) | APE, Berlin, Germany | – | – |
| Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II | Coherent, Duisburg, Germany | – | – |
| water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm | Olympus Germany, Hamburg, Germany | – | – |
References
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