חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

Abstract

תאי phagocytic לשחק תפקיד מרכזי במערכת החיסון המולדת על ידי הסרת וביטול מיקרואורגניזמים פולשים בphagosomes. התבגרות Phagosome היא התהליך המורכב והדוק מוסדר שבמהלכו phagosome המתהווה עובר שינוי דרסטי דרך אינטראקציות מתוזמרות היטב עם האברונים שונים סלולריים ותאים בציטופלסמה. תהליך זה, שהוא חיוני לתפקוד הפיזיולוגי של תאי phagocytic ידי מעניק phagosomes עם מאפייני ממס וbactericidal שלהם, מגיע לשיאו בשילוב של phagosomes עם lysosomes וקיום חיים של phagolysosomes שנחשב לשלב האחרון וקריטי של התבגרות לphagosomes. בדו"ח זה, אנו מתארים שיטה מבוססת הדמיה תא חי לניתוח איכותי וכמותי של התהליך הדינמי של הליזוזום לphagosome אספקת תוכן, שהוא סימן היכר של קיום חי phagolysosome. גישה זו משתמשת בmicrobeads מצופה IgG כמודל לphagocytosis ומולקולות dextran fluorophore-מצומדות כמו בדיקה מטעני lysosomal luminal, על מנת לעקוב אחר המשלוח הדינמי של תוכן lysosmal לphagosomes בזמן אמת במקרופאגים חיים באמצעות זמן לשגות הדמיה ומיקרוסקופיה לייזר confocal סריקה. כאן אנו מתארים בפירוט את הרקע, את שלבי ההכנה והתקנה ניסיונית צעד אחר צעד כדי לאפשר פריסה קלה ומדויקת של שיטה זו במעבדות אחרות. השיטה המתוארת שלנו היא פשוטה, חזקה, והכי חשוב, ניתן להתאים בקלות כדי לחקור אינטראקציות phagosomal והתבגרות במערכות שונות ותחת הגדרות ניסיוניות שונות, כגון שימוש בסוגים שונים תאי phagocytic, ניסויי הפסד של פונקציה, בדיקות שונות, ו חלקיקי phagocytic.

Introduction

phagocytes המקצועי, כוללים מקרופאגים, לשחק קריטי במערכת החיסונית. בנוסף להיותו קו הגנה הראשון של מערכת החיסון המולדת, הם גם לשחק תפקיד קריטי בהפעלה של החסינות אדפטיבית באמצעות האיתות ואנטיגן הצגת התפקיד ^1-3. בעוד שהפונקציה של phagocytes המקצועי היא רבת פנים, התבגרות phagosome היא עמוד השדרה הקריטית של פונקצית עיבוד bactericidal ואנטיגן של phagocytes המקצועי ^4,5. על היבלעות קולטן בתיווך והספיגה של יעד phagocytic, כגון חיידקים, phagosome המתהווה עובר רצף מורכב ומתוזמר היטב של אינטראקציה וחילופים עם תאים של רשת endocytic וכמה אברונים תאיים אחרים ^6. טבעו של התרכובות החליף עם גופים סלולריים אלה, כמו גם הרגולציה והתזמון של אירועי היתוך קובע את סביבת phagosomal luminal וphagosהרכב omal קרום, ולכן ^7, את גורלו של phagosome התבגרות ^8.

רלוונטי הפיזיולוגית של התבגרות phagosome מודגם על ידי האסטרטגיות המגוונות המועסקות על ידי פתוגנים תאיים שונים כדי לברוח מ, לעצור או לחתור תחת phagosome התבגרות ^9. רוב האסטרטגיות אלה במישרין או בעקיפין למנוע את השלב האחרון וקריטי של תהליך התבגרות phagosome: ההיתוך של phagosome עם תאי endosomal / lysosomal מאוחר, שמשווה להם את חלק הארי של אנזימי hydrolytic והגורמים אנטי בקטריאלי של phagosome בוגר ^{7 , 8,10.} ניתוח השלב האחרון וקריטי זו ולכן יכול לספק לנו אינדיקטורים חזקים על מצב ההבשלה של phagosomes ואם המצב הפיזיולוגי הטבעי הוא להיות חיובי או שלילי מושפע תחת ההגדרות הניסיוניות מסוימות כי הם מנוצלים.

תא endosomal מאוחר / lysosomal ים נחשב בדרך כלל להיות תאי המסוף של מסלול endocytic, מוגדרים ונבדלים מתאי endocytic המוקדמים על ידי הנוכחות של שונים, לביים מולקולות ספציפיות, סמן. למשל אנזימי hydrolytic או רכיבי קרום כגון חלבוני קרום lysosomal משויכים (מנורות) בין יתר ^11. Endocytic המסוף התייחסה מדורים מעתה בפשטות lysosomes-משמש גם כמקום המרכזי לשלבים הסופיים של מערכת העיכול בסוף phagocytic / endocytic המסלול ^12. בדרך זו, ניתן לטעון בדיקות nondigestible דרך אנדוציטוזה וmacropinocytosis מהסביבה תאית ומועברות דרך מסלול endocytic לlysosomes, שם הוא מצטבר ^13,14 לאחר ביצוע מחזור של ספיגה ומרדף מוגדר. בדיקות Fluorophore מצומדות למיקרוסקופ פלואורסצנטי כגון dextran פולימר nondigestible האורגני משמשות בדרך כלל כendocyticprobes ^15-17.

<p class = "jove_content"> בשיטה זו, אנו מתארים את הניצול של microbeads מצופה IgG כמטען phagocytic לחקור התבגרות phagosome ידי ניתוח אספקת תוכן luminal lysosomal לphagosomes. באמצעות בדיקה dextran fluorophore מצומדות כסמן לזיהוי בקלות של lysosomes במקרופאגים מח עצם לחיות נגזרים (BMM) ווידאו הדמיה הזמן לשגות עם מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה, אנו ממשיכים בתהליך הדינמי של משלוח המטען לphagosomes עם גבוה פתרון זמני. לאחר מכן, אנו מתארים כיצד ניתן להעריך את נתוני הזמן לשגות הדמיה נאספו באמצעות הקוד הפתוח ותוכנה זמינה באופן חופשי ניתוח תמונה, פיג'י (או ImageJ), מבחינה סטטיסטית נותח באמצעות Microsoft Excel ומוצג באמצעות תוכנת GraphPad פריזמה ^14,18.

לאחר התיאור של השיטה שלנו, יכולים להיות מתוכננים ניסויים מקבילים באמצעות הגדרות וגורמים שונה כדי לחקור את ההשפעה שלהם על התבגרות phagosome; כמעט כל otהסוג של תאי phagocytic ראשוניים או תא שורה חסיד שלה, אובדן גנטי של ניסויי פונקציה כוללים גן עקום החוצה ולדפוק למטה, מוטציות או ביטוי של חלבוני איחוי, phagocytic-מטרות, תרכובות ציפוי microbead, בדיקות endosomal / lysosomal וגורמים כגון ציטוקינים, מעכבים כימיים, או siRNA בין השאר הם כל המשתנים שניתן ליישם את הגישה הבסיסית של שיטה זו.

אנו מגדירים את המטרה ודרישות הבסיסיות של שיטה זו באופן הבא:

• מטרתה של השיטה: כדי לאפשר תצפית ישירה, כמוני ואיכותית וניתוח של התבגרות phagosome עם רזולוציה גבוהה זמנית בתאים חיים phagocytic.
• מטען phagocytic: microparticle מצופה כראוי או יעד ביולוגי. כאן אנו משתמשים IgG מצופה 3 מיקרומטר microparticles קלקר כדורי שהם הפנימו בקלות דרך phagocytosis קולטן בתיווך FC-γ. לחלופין, כל מיקרואורגניזם או מיקרופון מצופהניתן להשתמש roparticle שלקולט phagocytic נמצא על התאים.
• תאי phagocytic: תאי phagocytic חסיד המבטאים את הקולטנים phagocytic המתאימים. כאן אנו משתמשים BMMs עיקרי עכבר ששפע להביע את הקולטנים FC-γ. לחלופין, תאים דנדריטים (DC), מונוציטים או תאי אפיתל phagocytic או מוטציות הגנטיות שלהם או גרסאות עקום החוצה יכולים לשמש.
• מטען lysosomal: חללית lysosomal שכותרתו fluorescently. הנה, dextran 70,000 kiloDaltons (Dex70kD) מצומדת-טקסס האדומה משמש כמטען luminal של lysosomes. לחלופין, סמן כל fluorescently זיהוי של תא סלולארי או אברון, או בדיקה נאותה לנכסי phagosomal כגון קיבולת חומציות או degradative, יכול לשמש כדי לחקור את התקדמות הבשלת phagosome.
• השפעה גורמים: למשל, מולקולות איתות, תרכובות כימיות, גן עקום למטה, או ביטוי חולף של חלבוני מוטציה יכלו. הנה, יש לנו פרגאחד שימוש בגורם כזה לשם פשטות, אבל לדוגמה האחרונה עם ביטוי חלבון מוטציה וגורמים המשפיעים על לדפוק למטה ראו Kasmapour et al. ¹⁸ כל גורם שיכול להשפיע על phagocytosis או הנסיבות וניידות של phagosomes ו / או עלולים לשמש התאים שאינטראקציה עם phagosomes התבגרות.

Protocol

טיפול בבעלי חיים ואת כל הנהלים בפרוטוקול זה פעלו בהתאם להנחיות מוסדיות ולאומיות. הכן את ההכנות שמסומנות על ידי "Π-" לפני כן. 1. הכנת BMMs לבצ…

Representative Results

ההכנה הנכונה של התאים והחרוזים להדמיה היא קריטית. איור 1 מציג את קווי המתאר של הזריעה, בדיקה טעינה וצעדי הדמיה ראשוניות בשיטה זו, המבוסס על הפרוטוקול מותאם שלנו לBMMs. זה חיוני, אפוא, כי הפרמטרים הפרוטוקול להיבדק ומותאם בהתאם לסוג של תאים ובדיקות שיש לעשות שימו?…

Discussion

בסעיף הבא נדון שלבים קריטיים של השיטה המוצגת ומגבלותיו. יתר על כן, אנו יתחברו כמה מהבעיות הנפוצות בפתרונים שלהם, להציג את השינויים אפשריים, ורואים את היתרונות של השיטה שלנו, כמו גם שיטות משלימות מתאימות לגישה זו.

הכנת חרוזים, כולל …

Materials

Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)	PAA, Austria	E15-009
Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM)	PAA, Austria	E15-047
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAA, Austria	A15-151
L-Glutamine	PAA, Austria	M11-004
PBS	PAA, Austria	H15-002
Penicillin/Streptomycin	PAA, Austria	P11-010
WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5)	WillCo Wells, Netherlands	GWSt-3522
CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm	Greiner Bio one, Germany	627871	Alternative: Available as segmented
Carboxylated latex microspheres	Polysciences, USA	#09850	Available in different diameters, we used 3 μm
Polystyrene microparticles	Kisker Biotech, Germany	PPs-3.0COOH
Triton-X 100	ROTH, Germany	305.1.3
mouse whole IgG	Rockland, USA	010-0102
EDAC crosslinker	Sigma-Aldrich, USA	E6383-1g
10 mM Tris	Sigma-Aldrich,USA	T1503
1-ml syringe Omnifix -F	B.Braun, Germany	9161406V
26 G needle (0.45*25 mm)	B.Baun, Germany	4657683
RPMI 1640	PAA, Austria	E15-039
Horse Serum	Gibco, USA	16050-122
MES hydrate	Sigma-Aldrich, USA	M2933
0.2 μM syringe mounted filter	Sartorius, Germany	83.1826.001