Studio di fagolisosoma Biogenesis nei macrofagi in diretta
Abstract
Fagociti giocano un ruolo importante nel sistema immunitario innato rimuovendo ed eliminando microrganismi invasori nelle loro fagosomi. Phagosome maturazione è un processo complesso e strettamente regolata durante la quale un phagosome nascente subisce drastica trasformazione attraverso le interazioni ben orchestrate, con vari organuli cellulari e scomparti nel citoplasma. Questo processo, che è essenziale per la funzione fisiologica di fagociti dotando phagosomes con le loro proprietà litici e battericide, culmina nella fusione di phagosomes con i lisosomi e biogenesi dei phagolysosomes che è considerato come l'ultimo e fondamentale fase di maturazione per phagosomes. In questo rapporto, descriviamo un metodo basato imaging cellulare dal vivo per l'analisi qualitativa e quantitativa del processo dinamico di lisosomi per phagosome fornitura di contenuti, che è una caratteristica di fagolisosoma biogenesi. Questo approccio utilizza microsfere IgG rivestite come modello per phagocytosis e molecole di destrano fluoroforo coniugato come sonda carico lisosomiale luminale, per seguire la consegna di contenuto dinamico lysosmal ai fagosomi in tempo reale in macrofagi vivi usando time-lapse imaging e microscopia confocale. Qui si descrive nel dettaglio sullo sfondo, le fasi di preparazione e la configurazione step-by-step sperimentale per consentire la distribuzione facile e precisa di questo metodo in altri laboratori. Il nostro metodo descritto è semplice, robusta e, soprattutto, può essere facilmente adattato per studiare le interazioni phagosomal e maturazione in sistemi diversi e in varie impostazioni sperimentali, come l'uso di vari tipi di fagociti, la perdita di funzione esperimenti, diverse sonde, e particelle fagociti.
Introduction
Fagociti professionali, tra macrofagi, svolgono un fondamentale nel sistema immunitario. Oltre ad essere la prima linea di difesa del sistema immunitario innato, ma anche svolgere un ruolo critico nella attivazione della immunità adattativa attraverso la loro segnalazione e presentanti l'antigene ruolo 1-3. Mentre la funzione dei fagociti professionali è multiforme, phagosome maturazione è la spina dorsale critico della funzione di elaborazione battericida ed antigene dei fagociti professionali 4,5. Su engulfment recettore mediata e l'assorbimento di un bersaglio fagocitaria, come batteri, phagosome nascente passa attraverso una sequenza complessa ed armonico di interazione e scambi con compartimenti della rete endocitosi e diversi altri organelli cellulari 6. La natura dei composti scambiate con queste entità cellulari, nonché il regolamento e la tempistica degli eventi di fusione determina il phagosomal milieu luminale e le phagoscomposizione OMAL membrana e, quindi 7, il destino del phagosome maturazione 8.
La rilevanza fisiologica di phagosome maturazione è esemplificata dalle diverse strategie utilizzate dai vari agenti patogeni intracellulari di sfuggire, arresto o sovvertire phagosome maturazione 9. La maggior parte di queste strategie impediscono direttamente o indirettamente, la fase finale e critica del processo di maturazione phagosome: la fusione di phagosome con scomparti fine endosomal / lisosomiali, che conferisce loro la maggior parte degli enzimi idrolitici e fattori anti-batterici di un phagosome maturo 7 , 8,10. Analisi di questo passaggio finale e critico quindi ci può fornire con forti indicatori sullo stato di maturazione dei fagosomi e se lo stato fisiologico è essere positivamente o negativamente colpito sotto le impostazioni sperimentali particolari che vengono utilizzati.
Il vano tardi endosomal / lisosomiales sono generalmente considerati essere i compartimenti terminali della via endocitosi, definiti e distinti dai primi compartimenti endocitici dalla presenza di vari, determinata fase, molecole marcatori. Per esempio enzimi idrolitici o componenti di membrana quali le proteine di membrana lisosomiale associata (lampade) tra gli altri 11. Il terminale endocitica compartimenti-d'ora in poi indicato semplicemente come lisosomi-servono anche come location principale per le fasi finali della digestione, alla fine della fagocitosi / endocytic percorso 12. In questo modo, non digeribili sonde possono essere caricati tramite endocitosi e macropinocitosi dall'ambiente extracellulare e trasportati attraverso la via endocytic ai lisosomi, dove si accumula 13,14 dopo aver seguito un determinato ciclo di assorbimento e inseguimento. Sonde fluoroforo coniugato per la microscopia a fluorescenza come il destrano polimero organico nondigestible sono comunemente usati come endocyticprobes 15-17.
<p class = "jove_content"> In questo metodo, si descrive l'utilizzo di microsfere IgG rivestite come carico fagocitica indagare phagosome maturazione analizzando la consegna di lisosomiale contenuto luminale a phagosomes. Utilizzando una sonda destrano fluoroforo coniugato come marcatore facilmente rilevabile dei lisosomi nel midollo osseo dal vivo macrofagi derivati (BMM) e time-lapse video di imaging con un microscopio confocale a scansione laser, seguiamo il processo dinamico di consegna del carico in phagosomes con elevata risoluzione temporale. Abbiamo poi descrive come i dati di imaging time-lapse raccolti possono essere valutate utilizzando l'open-source e software di analisi dell'immagine liberamente disponibile, Fiji (o ImageJ), statisticamente analizzati utilizzando Microsoft Excel e presentata utilizzando il software GraphPad Prism 14,18.Dopo la descrizione del nostro metodo, esperimenti analoghi possono essere progettati utilizzando le impostazioni modificate e fattori di indagare la loro influenza sulla phagosome maturazione; qualsiasi otil suo tipo di fagociti primarie o linee cellulari aderenti, la perdita genetica degli esperimenti funzionali, tra cui gene knock-out e knock-down, mutanti o espressione delle proteine di fusione, fagocitosi-obiettivi, composti di rivestimento microbead, sonde endosomal / lisosomiali e fattori quali una citochine, inibitori chimici o siRNA tra gli altri sono tutte variabili che possono essere applicate per l'approccio di base di questo metodo.
Definiamo l'obiettivo e requisiti di base di questo metodo come segue:
- Obiettivo del metodo: per consentire l'osservazione diretta, quantitativa e qualitativa e l'analisi di phagosome maturazione con alta risoluzione temporale nel vivere fagociti.
- Carico dei fagociti: Un microparticelle opportunamente rivestiti o bersaglio biologico. Qui usiamo IgG-rivestito 3 micron microparticelle sferiche di polistirolo che sono prontamente interiorizzati attraverso il recettore Fc-γ fagocitosi mediata. In alternativa, qualsiasi microrganismo o un microfono patinataroparticle per i quali è presente un recettore fagocitica delle cellule può essere utilizzato.
- Fagociti: fagociti aderenti esprimono gli appropriati recettori fagociti. Qui usiamo il mouse BMMs primari abbondantemente esprimono i recettori Fc-γ. In alternativa, potrebbero essere utilizzati cellule dendritiche (DC), monociti o cellule epiteliali fagocitarie o loro mutanti o varianti genetiche knock-out.
- Lisosomiali cargo: Una sonda lisosomiale fluorescente. Qui, Texas Red-coniugato 70.000 kDa destrano (Dex70kD) è usato come il carico luminale dei lisosomi. In alternativa, qualsiasi marcatore fluorescente rilevabile di un compartimento cellulare o organello, o una sonda appropriata per le proprietà phagosomal come acidità o degradativa capacità, potrebbe essere utilizzata per studiare la progressione della phagosome maturazione.
- Fattori che influenzano: Ad esempio, molecole di segnalazione, composti chimici, gene knock-down, o espressione transiente di proteine mutanti potrebbe. Qui, abbiamo Förguno l'uso di tale fattore per semplicità, ma per un esempio recente con l'espressione della proteina mutante e di knock-down fattori che influenzano Si prega di vedere Kasmapour et al. 18 Qualsiasi fattore che può influenzare la fagocitosi o le circostanze e la mobilità dei phagosomes e / o compartimenti che interagiscono con phagosomes scadenza potrebbero essere utilizzati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nella sezione seguente si discuterà fasi critiche del metodo presentato e le sue limitazioni. Inoltre, ci si collegherà alcuni dei problemi comuni con le loro soluzioni, introdurre eventuali modifiche e valutare i vantaggi del nostro metodo così come i metodi complementari adatti per questo approccio.
La preparazione delle perline, compreso l'accoppiamento di IgG di superficie delle sfere, è cruciale e l'uso di preparati unfresh dovrebbe essere evitata. In aggiunta a ciò, è anc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del Laboratorio di Biologia phagosome per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è supportato da una sovvenzione Helmholtz Young Investigator (Iniziativa e Networking fondi dell'Associazione Helmholtz) e un programma di priorità SPP1580 Concessione del Consiglio per la ricerca tedesca (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
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