Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis'den Çalışması
Abstract
Fagositik hücreler kaldırma ve phagosomes istila mikroorganizmaları ortadan kaldırarak, doğuştan gelen bağışıklık sisteminde önemli bir rol oynamaktadır. Fagosom olgunlaşma olgunlaşmamış bir fagosom sitoplazmada çeşitli hücresel organellere ve bölmeleri ile iyi yönetilen bir etkileşimler yoluyla köklü dönüşüme uğrar sırasında karmaşık ve sıkı düzenlenmiş bir süreçtir. Onların litik ve bakterisidal özellikleri ile phagosomes donatarak fagositik hücrelerin fizyolojik fonksiyonu için gerekli olan bu süreç, lizozomlar ve phagosomes için olgunlaşma son ve kritik aşama olarak kabul edilir fagolizozomları arasında biyotekvinin ile phagosomes füzyonu sona eriyor. Bu raporda, biz phagolysosome biyotekvinin bir özelliğidir içerik dağıtım, fagosom için lizozoma dinamik süreci kalitatif ve kantitatif analiz için canlı hücre görüntüleme bazlı yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, phagocy için bir model olarak IgG kaplı mikro-boncuklar kullanırbir lizozomal luminal yük prob olarak apoptosisi ve fluorofor ile konjüge edilmiş dekstran molekülleri, zaman atlamalı görüntüleme ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak canlı makrofajlarda gerçek zamanlı olarak phagosomes için lysosmal dinamik içerik teslim takip etmek amacıyla. Burada ayrıntılı olarak arka plan, hazırlık aşamaları ve diğer laboratuvarlar bu yöntemin kolay ve hassas bir dağıtım sağlamak için adım adım bir deney düzeneği tarif. Bizim tanımlanan metot basit, sağlam, ve en önemlisi, kolayca farklı sistemlerde ve örneğin çeşitli fagositik hücreler türleri, kayıp-fonksiyon deneyleri, farklı prob kullanımı gibi çeşitli deneysel ayarları altında phagosomal etkileşimleri ve olgunlaşmasını çalışmak için adapte edilebilir, ve Fagositik parçacıklar.
Introduction
Makrofajlar dahil olmak üzere, profesyonel fagositlerin, bağışıklık sisteminde önemli bir oyun. Doğuştan gelen bağışıklık sistemindeki ilk savunma hattı olmasının yanı sıra, aynı zamanda bir rol 1-3 sunulması da sinyalizasyon ve antijen ile edinilmiş bağışıklık aktivasyonunda kritik bir rol oynamaktadır. Profesyonel fagositlerin işlevi çok yönlü iken, fagosom olgunlaşma profesyonel fagositlerin 4,5 bakterisit ve antijen işleme fonksiyonlarının kritik bir omurgadır. Reseptör aracılı yutulma ve bakteriler gibi bir fagositik hedef, alımından sonra, olgunlaşmamış fagosom etkileşim ve endositik ağ bölümlerinde ve çeşitli diğer hücresel organel 6 değişim karmaşık ve iyi ayarlanmış bir dizisi boyunca geçer. Bileşiklerin yapısı, bu hücresel varlıklar olarak düzenlenmesi ile değiştirilir ve füzyon olayların zamanlama luminal phagosomal ortamı ve phagos belirleromal membran bileşimi ve böylece 7, olgunlaşan fagozomun 8 kaderi.
Fagosom olgunlaşma fizyolojik alaka, kaçmak tutuklama veya fagosom olgunlaşmasını 9 yıkmak için çeşitli hücre içi patojenler tarafından istihdam çeşitli stratejiler ile örneklenmiştir. Hidrolitik enzim ve olgun fagozomun 7 arasında anti-bakteriyel faktörler bir kısmı ile endows geç endozomal / lızozomal bölmeli fagozomun füzyon: Bu stratejilerin çoğu doğrudan ya da dolaylı olarak fagosom olgunlaşma sürecinin son ve kritik aşamaya önlemek , 8,10. Doğal fizyolojik bir durum kullanılan ediliyor, özellikle deneysel ayarları altında etkilenen olumlu ya da olumsuz olması halinde, bu nihai ve kritik adım Analizi nedenle phagosomes olgunlaşma durumu hakkında güçlü göstergeler ile bize sağlayabilir ve.
Geç endozomal / lizozomal bölmesis genellikle çeşitli varlığı ile erken endositik bölmelerden tanımlanmış ve ayırt edici endositik yolunun terminal bölmeleri, spesifik, marker moleküllerin sahne olduğu kabul edilmektedir. Örneğin, diğerleri 11 arasında Lizozomal ilişkili membran proteinleri (lambalar) gibi hidrolitik enzimler veya membran bileşenleri için. Terminal endositik bölmeleri-bundan böyle lizozomlar-da fagositik / endositik yolunun 12 sonunda sindirim son aşamaları için ana konum olarak hizmet basitçe olarak anılacaktır. Bu şekilde, sindirilemez sondalar hücre dışı ortamdan endositoz ve makropinositoz yoluyla yüklenebilir ve alımı ve Chase belirlenmiş bir döngü takip sonra 13,14 birikir lizozomlara endositik yolu aracılığıyla taşınır. 15-17 endocyticprobes gibi organik sindirilemez polimer dekstran gibi floresan mikroskobu için fluorofor-konjuge problar yaygın olarak kullanılmaktadır.
<p clasbu yöntemde, s = "jove_content"> biz phagosomes için lızozomal luminal içerik teslim analiz ederek fagosom olgunlaşmasını araştırmak fagositik kargo olarak IgG kaplı mikroboncuk kullanımını tarif eder. Canlı kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMM) ve konfokal lazer tarama mikroskobu ile time-lapse video görüntülemede lizozomların bir kolaylıkla saptanabilir marker olarak flüorofor-konjuge dekstran prob kullanarak, yüksek olan phagosomes içine kargo teslim dinamik sürecini takip zamansal çözünürlük. Daha sonra istatistiksel olarak Microsoft Excel kullanarak analiz ve GraphPad yazılımı 14,18 kullanarak sunulan, toplanan time-lapse görüntüleme verileri, açık kaynak kodlu ve serbestçe kullanılabilir görüntü analiz yazılımı, Fiji (veya ImageJ) kullanılarak değerlendirilebilir anlatacağız.Bizim yöntemin açıklaması ardından, benzer deneyler fagosom olgunlaşması üzerindeki etkilerini araştırmak için modifiye ayarları ve faktörler kullanılarak dizayn edilebilir; hemen her otyapışık birincil veya hücre hattı fagositik hücrelerin kendi türü de dahil olmak üzere fonksiyon deneyler genetik kaybı gen nakavt ve knock-down, mutantlar veya füzyon proteinleri, fagositik-hedefler, microbead kaplama bileşikleri, endozomal / lizozomal sondaları ve faktörlerin böyle bir ifade diğerleri arasında sitokinler, kimyasal inhibitörleri veya siRNA bu yöntemin temel yaklaşım uygulanabilir tüm değişkenlerdir.
Biz aşağıdaki gibi bu yöntemin hedefi ve temel gereksinimlerini tanımlar:
- Yöntemin Hedef: fagositik canlı hücreler yüksek zamansal çözünürlüğe sahip fagosom olgunlaşma, doğrudan nicel ve nitel gözlem ve analiz sağlamaktır.
- Fagositik yük: Bir uygun şekilde kaplanmış mikro parçacık veya biyolojik hedef. Burada kolayca Fc-γ reseptörü aracılığıyla fagositoz ile içselleştirilir 3 um küresel polistiren mikro-IgG kaplı kullanın. Seçenek olarak ise, bir mikroorganizma ya da kaplanmış mikrofon, retina reseptör hücrelerde mevcut olduğu için roparticle kullanılabilir.
- Fagositik hücreler: Uygun fagositik reseptörlerini sentezleyen Yapışık fagositik hücreler. Burada bol Fc-γ reseptörlerini ifade fare primer BMMs kullanın. Alternatif olarak, dendritik hücreler (DC), monositler veya fagositik epitel hücreleri ya da bunların mutantlan ya da genetik knock-out varyantlar kullanılabilir.
- Lizozomal kargo: Bir floresan etiketli lizozomal prob. Burada, Texas Red-konjüge edilmiş dekstran 70,000 kiloDalton (Dex70kD) lizozomlara luminal yük olarak kullanılır. Alternatif olarak, bu asitlik veya indirgeyici kapasitesi phagosomal özellikleri için bir hücre bölmesi veya organel ya da uygun bir prob, floresan bir saptanabilir marker ile etiketlenebilir fagosom olgunlaşma ilerlemesini incelemek için kullanılabilir.
- Örneğin, molekülleri, kimyasal bileşikler, gen knock-down, ya da olabilir mutant proteinlerin geçici ifadesini sinyalizasyon: etkileyen faktörler. Burada, biz Förg varbasitlik uğruna böyle bir faktör biri kullanılması, ancak mutant protein ifade ve Kasmapour vd. 18. phagosomes fagositozunu veya şartlar ve hareketlilik etkileyebilir ve / olabilir Herhangi bir faktör bakın lütfen knock-down etkileyen faktörler ile yeni bir örnek ya da olgunlaşma phagosomes etkileşim bölmeleri potansiyel olarak kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aşağıdaki bölümde sunulan yöntem ve sınırlamalar kritik adımları görüşecek. Ayrıca, biz, onların çözümleri ile yaygın sorunlardan bazıları bağlamak olası değişiklikler tanıtmak ve bizim yöntemin avantajları yanı sıra, bu yaklaşıma uygun tamamlayıcı yöntemler dikkate alacaktır.
Boncuk yüzeye IgG bağlanması da dahil olmak üzere boncuklar, preparasyonu, önemlidir ve unfresh preparasyonlar kullanımından kaçınılmalıdır. Buna ilave olarak, dekstran t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yazının eleştirel okuma için fagosom Biyoloji Laboratuvarı üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma, bir Helmholtz Genç Araştırmacı hibe (Girişimi ve Helmholtz Derneği Ağ fonları) ve Öncelikli Programı Alman Araştırma Konseyi (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG) içinde SPP1580 Grant tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
References
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
- Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
- Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
- de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
- Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
- Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
- Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
- Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
- Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
- Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
- Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
- Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
- Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
- Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Aziz, M., Yang, W. -. L., Wang, P., Coliganet, J. E. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. 14, (2013).
- Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
- Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -. M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).
