Мы представляем сочетание крио-электронной микроскопии, липидов нанотехнологии и структурного анализа применяется для решения мембраносвязанное структуру двух весьма гомологичных FVIII формах: человека и свиньи. Методология, разработанная в нашей лаборатории, чтобы спирально организовать две функциональные рекомбинантные формы FVIII на отрицательно заряженных липидных нанотрубок (LNT) описывается.
Крио-электронной микроскопии (Крио-EM) 1 является мощным подход исследовать функциональную структуру белков и комплексов в гидратной государственной и мембранной среды 2.
Фактор свертывания крови VIII (фактора VIII) 3 многодоменный плазмы крови гликопротеин. Дефект или недостаток фактора VIII является причиной гемофилии типа А – тяжелое расстройство кровотечения. По протеолитической активации фактора VIII связывается с серинпротеазы Фактор IXa на отрицательно заряженной мембраны тромбоцитов, которая имеет решающее значение для нормального свертывания крови 4. Несмотря на ключевую роль фактора VIII играет в коагуляции, структурная информация для его мембраносвязанного государства является неполной 5. Рекомбинантный FVIII концентрат является наиболее эффективным средством против типа гемофилии А и коммерчески доступны FVIII может быть выражена как человека или свиньи, как при формировании функциональных комплексов с человеческим фактором IXa 6,7.
"> В этом исследовании мы представляем сочетание крио-электронной микроскопии (Крио-EM), липидов нанотехнологии и структурный анализ применяется для решения мембраносвязанное структуру двух весьма гомологичных форм фактора VIII:. Человеческий и свиной Методология, разработанная в нашей лаборатории на спирально организовать две функциональные рекомбинантные формы FVIII на отрицательно заряженных липидных нанотрубок (LNT) описывается. Представительные результаты показывают, что наш подход является достаточно чувствительным, чтобы определить различия в спиральной организации между ними высоко гомологичны в последовательности (идентичность последовательности 86% ) белки. Подробные протоколы для спиральной организации, Cryo-EM и электронной томографии (ET) сбора данных приведены. двумерной (2D) и трехмерной (3D) структурный анализ применяется для получения 3D-реконструкций человека и свиньи фактора VIII-LNT обсуждается. Представленные человека и свиньи структуры фактора VIII-LNT показать потенциал предлагаемой методологии для вычисэ функционал, связанный с мембраной организация свертывания крови фактора VIII с высоким разрешением.Фактор свертывания крови VIII (FVIII) является большой гликопротеин 2332 аминокислот, организованных в шесть областей: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. После активации тромбин FVIII действует как кофактор к фактору IXa в связанной с мембраной Тэнасе комплекса. Связывание активированного фактора VIII (FVIIIa) в FIXa в мембранный-зависимости образом повышает FIXa эффективность указанных протеолитических более 10 5 раз, что имеет решающее значение для эффективного свертывания крови 4. Несмотря на важную роль фактора VIII играет в коагуляции и образования комплекса Тэнасе, функциональная мембраносвязанный структура фактора VIII до сих пор не решен.
Для решения этой проблемы, одиночные липидного бислоя нанотрубки (LNT), богатые фосфатидилсерином (PS), способные связываться FVIII с высоким сродством 8, 9 и напоминающие поверхности активированных тромбоцитов были разработаны 10. Последовательный винтовая организация фактора VIII обязаны LNT было доказано быть эффективнойве для структуры определения фактора VIII мембраносвязанного государства по Cryo-EM 5. Функционализированный LNT являются идеальной системой для изучения белок-белковых и белок-мембрана взаимодействия спирально организованных мембранных белков, ассоциированных с Cryo-EM 11, 12. Криогенная EM имеет преимущество по сравнению с традиционными структурных методов, таких как рентгеновской кристаллографии и ЯМР, как образец сохраняется в ближайший к физиологической среде (буфер, мембраны, Ph), без добавок и изотопов. В случае фактора VIII, изучая мембраносвязанное структуру с этой техникой еще более физиологически значимым, так как LNT сильно напоминают по размеру, форме и составу псевдоподий из активированных тромбоцитов, где Тэнасе комплексы собирают в естественных условиях.
Дефекты и дефицит фактора VIII причины гемофилии А, тяжелым расстройством кровотечения, влияющих 1 в 5000 самцов человеческой популяции 4, 6. Наиболее еffective терапия для гемофилии А является пожизненное администрация рекомбинантного человеческого фактора VIII (hFVIII). Значительное осложнение рекомбинантного фактора VIII Гемофилия А терапии является развитие ингибирующих антител к человеческой форме, влияющих около 30% больных гемофилией А 13. В этом случае свиной FVIII (pFVIII) концентрат используется, как свиньи FVIII отображает низкой перекрестной реактивностью с ингибирующих антител против человеческого фактора VIII и форм функциональные комплексы с человеческим FIXa 7. Установление мембраносвязанное организацию как свиньи и форм человеческих FVIII важно понимать структурную основу функции кофактора фактора VIII и последствия для гемостаза крови.
В этом исследовании мы описываем сочетание липидов нанотехнологии, Cryo-EM и структурного анализа разработан, чтобы решить мембраносвязанное организацию двух весьма гомологичных форм фактора VIII. Представленные данные Крио-EM и 3D структуры для спирально организованной Porciпе и человеческого фактора VIII на отрицательно заряженной LNT показать потенциал предлагаемой нанотехнологии как основы для структуры определения фактора VIII и связанных с мембраной факторов и комплексов в физиологической среде мембраны коагуляции.
В этой работе методика представлена различать два мембраносвязанных организаций высоко гомологичных белков: человеческий и свиной FVIII самоорганизующихся на липидных нанотрубок в условиях, встречающихся в организме человека.
В описанной процедуры, ч…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа поддержана грантом Национального Ученый развития от American Heart Association: 10SDG3500034 и UTMB-NCB запуска средства для SSM. Авторы признают, средства Крио-EM и высокопроизводительные вычисления в Сили Центра структурной биологии UTMB ( www.scsb.utmb.edu ), а также д-ра. Стив Ludtke и Эд Egelman за помощь в спиральных алгоритмов реконструкции 2D и 3D.
JEM2100 with LaB6 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | operated at 200 kV |
with TEMCON software | JEOL Ltd. | ||
Gatan626 Cryo-holder | Gatan, Inc. | 626.DH | cooled to -175 °C |
with temperature controler unit | Gatan, Inc. | ||
Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Inc. | US4000 | 4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution |
Solarus Model 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. | ||
Vitrobot Mark IV | FEI | ||
Materials | |||
Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid | Ted Pella | 01821 | plasma cleaned for 10 s on high power |
Quantifoil R2/2 300 mesh | Electron Microscopy Sciences | Q225-CR2 | Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes |
Uranyl acetate dihydrate | Ted Pella | 19481 | 1% solution, filtered |
Galactosyl ceramide | Avanti Polar Lipids Inc. | 860546 | |
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | 840035 | |
Software | |||
EM software Digital Micrograph | Gatan, Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
EM software EMAN | free download | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ | |
EM software Spider | free download | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
EM software IHRSR | free download | Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | |
EM software (IMOD) | free download | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
EM software (SerialEM) | free download | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/ | |
UCSF-Chimera | free download | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html |