Sequentiële<em> In vivo</em> Imaging van Osteogeen Stam / progenitorcellen Tijdens Fracture Repair
Summary
Kwantitatieve meting van botvoorlopercellen functie de genezing van breuken vereist hoge resolutie seriële imaging technologie. Hier zijn protocollen voorzien met intravitale microscopie en osteo-lijn volgen sequentieel beeld en kwantificeren van de migratie, proliferatie en differentiatie van endogene osteogene stam / voorlopercellen in het proces van het herstellen botbreuken.
Abstract
Bone draait zich voortdurend en is sterk regeneratieve na letsel. Osteogenic stam / voorlopercellen zijn lang hypothese te bestaan, maar in vivo demonstratie van dergelijke cellen is pas onlangs gerealiseerd. Hier, in vivo beeldvorming technieken om de rol van endogene osteogene stam / progenitorcellen (OSPCs) en hun nageslacht in botherstel onderzoeken zijn aanwezig. Met osteo-cell lineage tracing modellen en intravitale geïnduceerde beeldvorming van haarscheurtjes in calvariale bot kan OSPCs direct worden waargenomen tijdens de eerste paar dagen na verwonding, waarbij kritische gebeurtenissen in de vroege reparatieproces optreden. Letsel sites kunnen achtereenvolgens worden afgebeeld onthullend dat OSPCs verhuizen naar de schade, in aantal toenemen en differentiëren tot botvormende osteoblasten. Deze methoden bieden een middel van het onderzoeken van de rol van stamcel-intrinsieke en extrinsieke moleculaire regulatoren voor de regeneratie van bot en reparatie.
Introduction
Degeneratieve botziekten en leeftijdsgebonden botverlies leidt tot een hoog risico op osteoporotische fracturen is uitgegroeid tot een belangrijke uitdaging in de volksgezondheid 1. Botbehoud wordt gecontroleerd door botvormende osteoblasten en-botresorberende osteoclasten. Gebreken van botvormende cellen zijn de voornaamste oorzaak van leeftijdsgebonden botverlies en degeneratieve botziekten 2,3. Hoewel uitgebreid onderzoek heeft zich gericht op de verbetering van de fractuur genezing, de ontdekking van betrouwbare drugs degeneratieve botziekten te genezen en om de zwakte van osteoporotische fracturen te keren blijft een belangrijke kwestie. Zo, het bestuderen van de bron van botvormende cellen en hun controlemechanismen in botherstel en reparatie voorziet in een nieuwe inzicht om het skelet regeneratie te verbeteren en reverse botverlies ziekten.
Het bestaan van multipotente mesenchymale cellen in beenmerg voorgesteld gebaseerd op de identificatie van Monogene populaties kunnen verschillendeIATE in osteogene, adipogene en chondrogenische geslachten ex vivo 4. Onlangs, meerdere studies hebben gerapporteerd dat het skelet / mesenchymale stamcellen (SSC's / MSC's) zijn een natuurlijke bron van osteoblasten en zijn cruciaal voor bot-omzet, verbouwing en fractuurherstel 5,6 . Bovendien, onze-lineage tracing studie bleek dat volwassen osteoblasten hebben een onverwacht korte halfwaardetijd (~ 60 dagen) en worden voortdurend aangevuld door hun stam / voorlopercellen in zowel normale homeostatische en fractuurherstel voorwaarden 6. Echter, de in vivo identiteit van stamcellen en hoe dergelijke cellen reageren op letsel breken en leveren botvormende cellen zijn onduidelijk. Daarom is het belangrijk een methode kan de migratie, proliferatie en differentiatie van endogene SSC / MSC analyseren onder fysiologische omstandigheden ontwikkelen.
Breukherstel is een multi-cellulaire en dynamisch proces geregeld door een reeks complexecytokinen en groeifactoren 7. De meest populaire aanpak voor fractuur onderzoeksprogramma is om een diermodel met pijpbeenfracturen gebruiken en botten te analyseren door het bot snijden en immunofluorescentie technieken 8-10. Deze reparatie kan gevolgd worden door meerdere beeldvormende technieken waaronder micro-CT 11, nabij infrarood fluorescentie 12 en chemiluminescentie beeldvorming 13. Echter, elke techniek heeft bepaalde beperkingen en er geen effectieve manier om SSC / MSC functie op cellulair niveau in vivo volgen geweest. Onlangs heeft confocale / twee-foton intravitale microscopie ontwikkeld en gebruikt om getransplanteerde kankercellen en hematopoietische stamcellen te detecteren in het kader van hun beenmerg micro zelfs bij eencellige resolutie levende dieren 14. Door de combinatie van deze technologie met een reeks van lineage tracing modellen, waren we in staat om te bepalen dat osteogenic stam / voorlopercellen genetisch kunnen worden gemarkeerd door tijdelijke aczendvermogen van de myxovirus weerstand -1 (Mx1) promotor en-Mx1 geïnduceerde voorlopers kunnen de meeste rijpe osteoblasten te handhaven in de tijd maar niet deelnemen aan de vorming van chondrocyten in de volwassen muis 6. Daarnaast hebben we aangetoond dat Mx1-gelabelde OSPCs leveren de meerderheid van de nieuwe osteoblasten de genezing van breuken 6.
Hier, met osteo-lijn volgen modellen intravitale microscopie wordt een protocol voorzien om de in vivo kinetiek van Mx1 + osteogene stam / progenitorcellen in breukherstel definiëren. Dit protocol biedt sequentiële beeldvorming om de verplaatsing van osteogene stam / progenitorcellen in breukplaatsen en de kwantitatieve meting van osteoprogenitor expansie in het begin reparatieproces volgen. Deze benadering kan nuttig zijn in meerdere contexten zoals de evaluatie van de therapeutische kandidaten om botherstel verbeteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De regulering van skeletachtige stamcellen kan van groot belang zijn voor het definiëren van betere methoden bot regeneratie. Kwantitatieve en sequentiële beeldvorming op cellulair niveau is technisch uitdagend geweest. Hoewel de muis pijpbeenfracturen model is op grote schaal gebruikt en geschikt voor biomechanische studies 17, hebben de deep tissue locatie, ongelijke breuk grootte, zacht weefsel schade, en de toepassing van stabiliserende fixators sequentiële intravitale beeldvorming beperkt. Hier wordt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken C. Park voor het lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de NIAMS onder Award Aantal K01AR061434 en een Leukemia & Lymphoma Society Fellowship Award (5127-09) naar DP en subsidies van de National Institutes of Health voor CPL en DTS De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.
Materials
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
References
- Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
- Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
- Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
- Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
- O’Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
- Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
- Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).
