シーケンシャル<em>インビボ</em>骨折修復中に、骨形成幹細胞/前駆細胞のイメージング
Summary
骨折治癒における骨前駆細胞機能の定量測定は、高分解能シリアルイメージング技術を必要とします。ここで、プロトコルは、画像を順次かつ骨折の修復過程における内因性の骨形成幹細胞/前駆細胞の移動、増殖および分化を定量化する生体顕微鏡と骨系統トラッキングを使用するために提供される。
Abstract
骨が継続的にオーバーになり、非常に再生損傷後です。骨形成幹/前駆細胞が存在して長いと仮定されているが、そのような細胞のインビボでの実証にごく最近達成された。ここで、内因性の骨形成幹/前駆細胞（OSPCs）および骨修復におけるそれらの子孫の役割を調査するためのインビボイメージング技法が提供される。モデルや頭蓋冠骨における誘導微小破壊の生体内イメージングをトレース骨系細胞を使用して、OSPCs直接の早期修復過程における重要なイベントが発生する損傷後最初の数日間に観察することができる。損傷部位を順次OSPCsが、怪我に移転数が増加し、骨形成骨芽細胞に分化することを明らかに画像化することができる。これらのメソッドは、骨の再生および修復のための幹細胞内因性および外因性の分子制御因子の役割を調査する手段を提供します。
Introduction
骨粗しょう症性骨折のリスクが高いにつながる変性骨疾患及び年齢関連骨量減少は、公衆衛生1における大きな課題となっている。骨の維持、骨形成性骨芽細胞と骨吸収破骨細胞によって制御される。骨形成細胞の欠陥は、年齢関連骨量減少および変性骨疾患2,3の主な原因である。大規模な研究は、骨折治癒の改善に焦点を当てているが、変形性骨疾患を治すと骨粗鬆症による骨折の弱点を逆に信頼性の高い医薬品の発見は重要な課題である。したがって、骨の再生および修復における骨形成細胞およびそれらの制御機構の源を研究する骨格再生を促進し、骨量減少疾患を逆転させる新規な洞察を提供する。
骨髄中の多能性間葉細胞の存在は、異なる可能性クローン原集団の同定に基づいて提案されている骨形成にiate、脂肪形成および軟骨形成の系統は、ex vivoで4。最近では、複数の研究は、骨格/間葉系幹細胞（SSCは/ MSCは）骨芽細胞の自然源であり、骨代謝回転、改造、及び骨折修復5,6のために重要であることを報告している。加えて、我々の系譜追跡研究では、成熟骨芽細胞が突然短い半減期（〜60日）があり、継続的に正常な恒常性と骨折修復の条件6の両方で彼らの幹細胞/前駆細胞によって補充されることを明らかにした。しかし、in vivoでの幹細胞のアイデンティティとどのような細胞が傷害やサプライ骨形成細胞を破砕するために反応は不明である。したがって、生理的状況下における内因性のSSC / MSCの遊走、増殖および分化を分析することができる方法を開発することが重要である。
骨折修復複合体の配列によって調節され、多細胞および動的なプロセスであるサイトカインおよび増殖因子7。骨折の研究のための最も一般的なアプローチは、長骨骨折を有する動物モデルを使用し、骨切片および免疫蛍光技法8-10によって骨を分析することである。この修復プロセスは、マイクロCT 11、近赤外蛍光12、および化学発光イメージング13を含む複数の画像化技術によってモニターすることができる。しかし、各技術は、一定の制限があり、in vivoでの細胞レベルでのSSC / MSC機能を監視する有効な方法がなかった。最近では、共焦点/二光子生体顕微鏡が開発され、動物14を生体内にあっても単細胞の解像度でそれらの骨髄微小環境のコンテキスト内で移植された癌細胞及び造血幹細胞を検出するために使用されている。系統トレース一連のモデルでこの技術を組み合わせることで、骨形成幹/前駆細胞が遺伝的に一過交流でマークすることができることを定義することができたミクソウイルス耐性-1（Mx1の ）プロモーターとMX1〜誘起前駆細胞のtivationは、時間の経過とともに成熟骨芽細胞の大部分を維持することができますが、成体マウス6に軟骨細胞の生成に関与しません。加えて、我々はMX1〜ラベルOSPCsが骨折治癒6で新しい骨芽細胞の大半を供給していることを明らかにした。
ここで、骨系統追跡モデルと生体顕微鏡を用いて、プロトコルは、骨折修復におけるMx1の+骨形成性幹/前駆細胞のin vivo動態を定義するために設けられている。このプロトコルは、骨折部位への骨形成幹/前駆細胞の移設と早期修復過程における骨前駆拡大の定量的な測定を追跡するために、順次画像を提供しています。このアプローチは、骨修復を改善するための治療候補の評価を含む複数のコンテキストで有用であり得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
骨格筋幹細胞の調節は、骨再生を達成するためのよりよい方法を定義するために非常に重要であり得る。細胞レベルで定量的かつ連続的なイメージングは、技術的に困難となっている。マウスの長期骨折モデルが広く使用され、生体力学的研究17に適してきたが、その深部組織の位置、不均一な破断サイズ、軟組織の損傷、および安定化固定具の適用は、順次生体内イメージング…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿を読み取るためで公園に感謝します。この作品は、内容はもっぱら著者の責任であり、ないDPとCPLとDTSの国立衛生研究所の助成金を受賞番号K01AR061434と白血病リンパ腫協会フェローシップ賞（5127から09）の下でNIAMSによってサポートされていました必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表しています。
Materials
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
References
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