Tre Culture dimensionali: strumento per studiare normale acinose Architettura vs trasformazione maligna delle cellule mammarie
Summary
Tre coltura tridimensionale di cellule epiteliali mammarie su una membrana basale ricostituita è un metodo utile ricordare l'architettura in vivo del seno benigno, e per differenziare il fenotipo maligno dal fenotipo seno benigno. È importante sottolineare che questo sistema può essere applicato a studiare carcinomi invasivi in altri tessuti.
Abstract
Carcinomi mammari invasivi sono un gruppo di tumori epiteliali maligni caratterizzato dall'invasione dei tessuti adiacenti e la propensione a metastatizzare. L'interazione dei segnali tra le cellule tumorali e il loro microambiente esercita una forte influenza sulla crescita del cancro al seno e comportamento biologico 1. Tuttavia, la maggior parte di questi segnali dalla matrice extracellulare sono persi o loro rilevanza è understudied quando le cellule vengono coltivate in coltura due dimensioni (2D) come un monostrato. Negli ultimi anni, tridimensionale coltura su una membrana basale ricostituita (3D) è emerso come un metodo di scelta per ricapitolare dell'architettura tissutale di cellule mammarie benigne e maligne. Le cellule coltivate in 3D conservano gli spunti importanti della matrice extracellulare e forniscono un fisiologicamente rilevanti ex vivo di sistema 2,3. Di nota, vi è una crescente evidenza che suggerisce che le cellule si comportano diversamente quando coltivate in 3D rispetto al 2D 4. Cultura 3Dpuò essere usato efficacemente come mezzo per differenziare il fenotipo maligno dal fenotipo seno benigna e per consolidare la segnalazione cellulare e molecolare coinvolto 3. Una delle caratteristiche distintive di cellule epiteliali benigne è che essi sono polarizzati in modo che il citoplasma apicale è verso il lume e il citoplasma basale poggia sulla membrana basale. Questa polarità apico-basale si perde in carcinomi mammari invasivi, che sono caratterizzate da disorganizzazione e la formazione di anastomosi e la ramificazione tubuli che si infiltra a casaccio lo stroma circostante cellulare. Queste differenze istopatologici tra ghiandola benigna e il carcinoma invasivo possono essere riprodotti in 3D 6,7. Utilizzando le opportune read-out come il quantificazione di singole strutture acinose rotonde, o differenziale espressione di marcatori molecolari validati per la proliferazione cellulare, la polarità e l'apoptosi in combinazione con altre tecniche di biologia molecolare e cellulare, cultur 3De in grado di fornire uno strumento importante per comprendere meglio i cambiamenti cellulari durante la trasformazione maligna e per delineare la segnalazione responsabile.
Introduction
Tre coltura tridimensionale (3D) di cellule epiteliali mammarie sulla membrana basale ricostituita è un importante sistema modello per studiare il complesso fenotipo e segnalazione associato di seno normale e cancro al seno 2,3. L'unità funzionale del seno è il terminale condotto unità lobulare (TDLU) che consiste in un piccolo dotto che si dirama in acini. Gli acini sono strutture altamente organizzate, composto da due strati di cellule, cellule epiteliali e mioepiteliali, che sono circondate da una membrana basale 5. Le caratteristiche più distintive di acini normali sono polarizzazione cellulare, attacco alla membrana basale sottostante e comunicazione varie cellule specializzate. Questa organizzazione intricato è interrotto nei carcinomi invasivi. Le culture 2D ampiamente utilizzato, dove le cellule sono coltivate in monostrato, non consentono la formazione di acini. Così, la coltura monostrato manca nel fornire un sistema per catturare l'intricata relazione tra le cellule epitelialiin seno normale e la loro deregolamentazione nel cancro al seno. Culture epiteliali monotipica funzionali delle cellule mammarie sono state sviluppate in diversi laboratori 2,3. Cultura 3D coinvolge la crescita delle cellule del seno su Matrigel, che è un estratto solubilizzato derivato da cellule di topo sarcoma Engelbreth-Holm-Swarm ed è disponibile in commercio. Altri substrati 3D come il collagene che vengono utilizzati anche. Le cellule del seno possono essere coltivate in 3D da 3D saggio incorporato, in cui le cellule sono coltivate incorporato in Matrigel 2. In alternativa, le cellule possono essere coltivate da 3D sul dosaggio superiore, chiamato anche saggio overlay 3D, che è conveniente in quanto richiede minor volume di Matrigel, e facilita il controllo di lasso di tempo di formazione della colonia mediante imaging a contrasto di fase ed è ideale per l'imaging in situ 2 -3. Il 3D sulla cima saggio è stato usato per definire la correlazione tra il fenotipo acinose e profilo di espressione genica 7.
Cultura 3D può essere effectively utilizzato per distinguere le cellule normali e benigne da carcinoma invasivo. Cellule del seno normale e benigni formano la crescita arrestato strutture polarizzate con un lume ben definite nel centro di Matrigel mentre le cellule di carcinoma invasivo crescono prolifico e casaccio, senza compensazione del lume. E6/E7 immortalato cellule epiteliali mammarie umane e linea cellulare MCF10A, che è una linea cellulare spontaneamente immortalato isolato da un paziente di 36 anni con i cambiamenti fibrocistica, sono stati utilizzati con successo per riconquistare il fenotipo benigna del seno in 3D 3,8 e hanno servito come un sistema modello per studiare la funzione di soppressore tumorale oncogenica e di diverse molecole 8,9. Queste cellule benigne può essere progettato per manipolare gene (s) di interesse con l'introduzione di lentivirus / retrovirus. Se il gene (s) di interesse è un soppressore del tumore, l'abbattimento shRNA mediata porterà ad una trasformazione maligna mentre se il gene di interesse è una sovraespressione oncogene in cellule benignedovrebbe mostrare un fenotipo maligno. In entrambi i casi le strutture acinose formate in 3D possono catturare la trasformazione maligna.
Benigni singole cellule placcato in 3D iniziano a proliferare e formare rotondo strutture sferiche. Di giorno 5-8 questo aggregato sferico delle cellule sarà differenziarsi in uno strato circostante polarizzata di celle che è in contatto con la Matrigel, e una massa interna di cellule meno polarizzate, che mancano contatto con la Matrigel. Nei prossimi 10-15 giorni le cellule interne inizieranno a morire per apoptosi formando un chiaro lume. Le cellule maligne cresceranno a casaccio perdere la loro polarità. Cellule altamente maligne di solito formano ramificazione delle strutture. Queste differenze nel fenotipo possono essere catturati da tempo di imaging a contrasto di fase, periodo e in situ immunoistochimica con marcatori molecolari rilevanti. I marcatori più comunemente utilizzati sono alfa 6-integrina, un marcatore polarità basale, in combinazione con il marcatore di proliferazione fosfo-istone 3 e il apoptotic marcatore spaccati caspasi-3. Quest'ultimo è importante determinare se vi è formazione di lumen nel centro degli acini, una caratteristica delle cellule normali del seno e benigne. Altri marcatori di polarità e di contatto cellula-cellula comprendono GM130, laminina, ERM, E-caderina. Alternativamente le linee di cellule di cancro al seno può essere progettato per manipolare il gene di interesse. In questo caso reversione ad una maggiore crescita arrestata fenotipo benigno può essere utilizzato come lettura per distinguere dal fenotipo cancro.
Cultura 3D può essere utilizzato anche con attenzione a delineare le vie di segnalazione coinvolte nella trasformazione maligna 10-11. Utilizzando il sopra citato le letture, inibitori farmacologici, anticorpi bloccanti o proteine ricombinanti può essere utilizzato da individuare nella segnalazione molecolare che porta alla trasformazione maligna. Con un impegno costante da vari laboratori è possibile estrarre le cellule dal 3D per isolare l'RNA e anche preparare lisati per immunoblotting e immunitànoprecipitation. Queste strategie sono descritte in un graduale e modo dettagliato nel protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo descritto qui la coltura tridimensionale di cellule epiteliali mammarie su una membrana basale ricostituita e l'utilità di questo sistema di distinguere tra vs maligno benigno fenotipo seno. Questo sistema può essere utilizzato anche per coltura diversi tipi di cellule di altri tessuti ghiandolari ed è stato riportato che sono stati utilizzati con successo per cultura prostata epiteliale, epiteliale bronchiale, e cellule epiteliali tiroidee, per citarne alcuni 12-14. L'importanza della cult…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R01 CA107469, R01 CA125577, e U01CA154224 di CG Kleer, la University of Cancer Support Center del Michigan.
Materials
| Growth Factor Reduced matrigel | BD biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2- well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientifics | MAB1378 | 1:00 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:00 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientifics | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
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