Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı
Summary
Bir tekrar oluşturulmuş temel membran üzerinde meme epitelyum hücreleri üç boyutlu kültür iyi huylu meme in vivo mimari özetlemek için, iyi huylu göğüs ve fenotipten malin fenotipi ayırt etmek için yararlı bir yöntemdir. Önemli olarak, bu sistem, diğer dokularda invaziv karsinomları incelemek için uygulanabilir.
Abstract
Invaziv meme karsinom metastaz komşu doku ve eğilimi işgali ile karakterize malign epitelyal tümörlerin bir grubuz. Kanser hücreleri ve bunların mikro arasındaki sinyallerin etkileşimi meme kanseri büyüme ve biyolojik davranışı 1 üzerinde güçlü bir etkiye sahip. Ancak, hücre dışı matrisin bu sinyallerin çoğu kaybolur ya da hücreler, bir tek tabaka iki boyutlu kültürü (2B) yetiştirilen onların İlgiye understudied edilir. Son yıllarda, bir tekrar oluşturulmuş temel membran üç boyutlu (3D) bir kültür iyi huylu ve habis meme hücrelerinin doku mimarisi özetlemek için tercih edilen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. 3D yetiştirilen hücreler, hücre dışı matris arasındaki önemli ipuçları korumak ve fizyolojik olarak uygun ex vivo sistem 2,3 sağlar. Notun, 2D 4 kıyasla 3D yetiştirilen hücreler, farklı davranabilir düşündüren kanıtlar artmaktadır. 3D kültüretkin bir şekilde 3 dahil iyi huylu göğüs fenotipten malin fenotipi ayırt etmek için bir araç olarak ve hücresel ve moleküler sinyal destekleyen için kullanılabilir. Iyi huylu epitelyal hücrelerin ayırt edici özelliklerinden biri, apikal sitoplazma lümenine doğru ve bazal sitoplazma bazal membran üzerinde durmaktadır, böylece de polarize edilmiş olmasıdır. Bu apico-bazal polarite hücresel örgütsüzlük ve gelişigüzel çevreleyen dokudan infiltrasyonlar tübüllerini anastomoz ve dallanma oluşumu ile karakterize edilir invaziv meme kanserleri, kaybolur. Benign bezi ve invaziv karsinoma arasındaki bu histopatolojik farklılıklar 3D 6,7 çoğaltılabilir. Diğer moleküler ve hücre biyolojisi teknikleri, 3D Kültür ile birlikte hücre çoğalması, polarite ve apoptoz valide moleküler belirteçlerin ifade diferansiyel, tek yuvarlak asiner yapılardan niceliğinin gibi uygun okuma-çıkışları ya da kullanmae daha malign dönüşüm sırasında ve sorumlu sinyalizasyon tasvir için hücresel değişiklikleri anlamak için önemli bir araç sağlayabilir.
Introduction
Yeniden oluşturulmuş bazal zar üzerinde göğüs epitel hücrelerinin kültür üç boyutlu (3D) karmaşık fenotip ve normal meme ve meme kanseri 2,3 bağlantılı sinyal incelemek için önemli bir model sistem. Memenin fonksiyonel birim içine asinüs hangi dal küçük bir kanal oluşur terminal lobular kanal ünitesi (TDLU) 'dir. Acininin bir bazal membran 5 tarafından çevrelenmiş olan iki hücre tabakası, epitelyal ve myoepitelyal hücreler, oluşan yüksek derecede organize yapılar bulunmaktadır. Normal asinüs en ayırt edici özellikleri hücresel kutuplaşma, altta yatan bazal membran bağlanma ve özel hücre-hücre temas vardır. Bu karmaşık örgüt invaziv tümörlerde bozulur. Hücre mono tabakaları olarak yetiştirilen yaygın olarak kullanılan 2 boyutlu kültürler, asinüs oluşumu için izin yoktur. Bu nedenle, tek tabakalı bir kültür epitel hücreleri arasındaki karmaşık ilişkiyi yakalamak için bir sistem temin yoksundurnormal göğüs ve göğüs kanserinde kendi düzensizleşmesine. Meme hücrelerinin fonksiyonel tek tip epitel kültürleri çeşitli laboratuarlar 2,3 geliştirilmiştir. 3D kültür Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücrelerinden türetilen bir çözünebilir ekstresi ve ticari olarak mevcuttur, Matrigel üzerinde göğüs hücrelerinin büyümesini kapsar. Kolajen gibi diğer 3D katmanlarından Ben de kullanılmaktadır. Meme hücreleri hücreleri, Matrigel 2 gömülü kültürlenir 3D gömülü deneyi ile 3D kültürlenebilir. Alternatif olarak, hücreler de bu Matrigelin az bir hacim gerektirir, ve faz kontrast görüntüleme ile koloni oluşumunun zaman atlamalı izlenmesini kolaylaştırır ve in situ görüntüleme 2 için ideal olduğu gibi maliyetli 3D bindirme deneyi olarak adlandırılan, üst deneyine 3D kültür edilebilir -3. En iyi tahlil üzerinde 3D asinar fenotip ve gen ekspresyon profili 7 arasındaki ilişkiyi tanımlamak için kullanılmıştır.
3D kültür effectiv edilebilirely invaziv karsinom normal ve iyi huylu hücreleri ayırt etmek için kullanılır. Normal ve iyi huylu meme hücrelerinin invaziv karsinom hücreleri lümen hiçbir temizlenmesi ile üretken ve gelişigüzel büyümeye ise büyüme Matrigel merkezinde iyi tanımlanmış lümen polarize yapılar tutuklandı oluştururlar. E6/E7 insan meme epitelyum hücreleri ve fibrokistik değişiklikleri ile bir 36 yaşındaki hastadan izole edilmiş bir kendiliğinden ölümsüzleştirilmiş hücre hattı, başarılı bir 3D 3,8 olarak iyi huylu göğüs fenotipi geri almak için kullanılmış olan ve yapmış olduğu MCF10A hücre hattı, ölümsüzleştirilmiş Birkaç moleküllerin 8,9 onkojenik ve tümör baskılayıcı fonksiyonunu incelemek için bir model sistem. Bu iyi huylu hücre lentivirüs / retrovirüs tanıtımı ile, ilgilenilen gen (ler) işlemek için tasarlanmış olabilir. Ilgi konusu gen (ler), bir tümör bastırıcı ise ilgi konusu genin benign hücrelerde onkogen aşın ise, shRNA aracılık ettiği portatif ise kötü huylu bir dönüşüme yol açacaktırhabis bir fenotipe göstermelidir. Her iki durumda da 3 boyutlu olarak oluşturulmuş akinar yapılar habis dönüşüm yakalayabilir.
3D kaplama huylu tek hücreler küresel yapılar çoğalırlar ve yuvarlak oluşturmaya başlar. Gün 5-8 hücreleri, bu küresel toplam Matrigel ile temas halinde olan hücre çevreleyen bir polarize tabakası ve Matrigel ile temas eksikliği az polarize hücre, bir iç bir kitle halinde ayırt edecektir. Önümüzdeki 10-15 gün içinde iç hücreler apoptosis açık bir lümen oluşturarak ölmeye başlayacak. Malign hücreler gelişigüzel polaritelerini kaybetme büyüyecek. Son derece habis hücreler genellikle yapıları dallanma oluştururlar. Fenotip bu farklılıklar, zaman atlamalı faz kontrast görüntüleme ve yerinde ilgili moleküler belirteçlerin ile immünboyama tarafından yakalanabilir. En sık kullanılan işaretleyiciler çoğalma işaretleyici fosfo histon 3 ile apoptot ile kombinasyon halinde, alfa 6-integrin, bir taban kutup işaretleridiric işaretleyici kaspaz-3 ayrılır. İkincisi asinüs merkezinde, normal ve iyi huylu meme hücrelerinin bir özellik olarak lümen oluşumu olup olmadığını belirlemek için önemlidir. Diğer polarizasyon ve hücre-hücre temas belirteçleri GM130, laminin, şey, E-kadherin içerir. Seçenek olarak, göğüs kanseri hücre çizgileri, ilgi konusu geni işlemek için tasarlanmış olabilir. Tutuklandı daha büyümeye Bu durumda, eski haline dönme olarak iyi huylu fenotip olarak kullanılabilecek bir kanser fenotipi ayırt etmek okunur.
3D kültürü de dikkatle habis dönüşüm 10-11 katılan sinyalleme yolunu tanımlamak için kullanılabilir. Kullanılarak yukarıda salt çıkışları, farmakolojik inhibitörleri, bloke edici antikorlar veya rekombinant proteinleri söz habis dönüşüme neden olan moleküler sinyali de kesin olarak belirlemek olabilir kullanılabilir. Çeşitli laboratuvarların sürekli çabaları sayesinde RNA izole etmek ve aynı zamanda immunoblotlama ve immünohistokimyası için lizatlarını hazırlamak için 3 boyutlu hücreleri çıkarmak mümkündürnoprecipitation. Bu stratejiler, protokolde bir adım adım ve ayrıntılı bir şekilde tarif edilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada bir tekrar oluşturulmuş temel membran üzerinde göğüs epitel hücrelerinin üç boyutlu kültür ve habis genel iyi huylu göğüs fenotip arasında ayrım yapmak için, bu sistemin yararını tanımlamışlardır. Bu sistem aynı zamanda, diğer glandular dokulardan kültür farklı hücre tipleri için kullanılabilir ve başarılı bir kaç 12-14 isim, kültür prostat epitel, bronşiyal epitel ve epitel hücrelerine tiroid kullanılmıştır bildirilmiştir. 3D kültür önemi, fizyolojik olar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe R01 CA107469, R01 CA125577 ve CG Kleer, Michigan Kanser Merkezi Destek Üniversitesi U01CA154224 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Growth Factor Reduced matrigel | BD biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2- well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientifics | MAB1378 | 1:00 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:00 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientifics | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
References
- Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. Stroma in breast development and disease. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).
- Rosen, P. P., Rosen, P. . Rosen’s breast pathology. , (2008).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer. Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).
- Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor. Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).
- Wang, F., et al. Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts. J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Wang, R., et al. Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone. Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).
- Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells. Differentiation. 74, 141-148 (2006).
- Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes. Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8, 1-11 (2013).
