Un enlisement test: Un protocole pour évaluer les interactions entre les neurones du système nerveux central et les phagocytes
Summary
Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) avec une grande capacité à phagocyter ou engloutir matériau dans leur environnement extracellulaire. Ici, un test largement applicable, fiable et hautement quantitative pour la visualisation et la mesure de l'engloutissement de la microglie médiation de composants synaptiques est décrite.
Abstract
La phagocytose est un procédé dans lequel une cellule engloutit matériau (cellule entière, des parties d'une cellule, des débris, etc) dans son environnement extracellulaire environnant et digère ce matériau, généralement par suite, la dégradation lysosomale. Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) dont la fonction phagocytaire a été décrit dans une large gamme de conditions de maladie neuro-dégénérative (par exemple, la clairance de la bêta-amyloïde dans la maladie d'Alzheimer) pour le développement du cerveau en bonne santé (par exemple, synaptique élagage) 1-6. Le protocole suivant est un test de l'engloutissement développé de visualiser et de quantifier l'engloutissement de la microglie médiation d'entrées synaptiques dans le développement du système de retinogeniculate de la souris 7. Bien que cet essai a été utilisé pour évaluer la fonction de la microglie dans ce contexte particulier, une approche similaire peut être utilisée pour évaluer d'autres phagocytes dans l'ensemble du cerveau (par exemple, les astrocytes) et le reste du corps(par exemple, les macrophages périphériques) ainsi que d'autres contextes dans lesquels remodelage synaptique se produit (par exemple, une lésion cérébrale / maladies).
Introduction
Circuits synaptiques remodeler tout au long de la vie d'un animal. Dans le développement du cerveau, les synapses se forment dans l'excès et doivent subir l'élagage synaptique qui implique l'élimination sélective d'un sous-ensemble de synapses et le maintien et le renforcement de ces synapses qui restent 8-10. Ce procédé est nécessaire pour réaliser la connectivité caractéristique précise du système nerveux adulte. Chez l'adulte, les synapses peuvent également être en plastique, en particulier dans le contexte de l'apprentissage et de la mémoire. Les corrélats structurels de cette plasticité sont pensés pour inclure l'ajout et / ou l'élimination des épines dendritiques et boutons présynaptiques 11-13. En plus de ces rôles dans le système nerveux sain, remodelage synaptique est également impliqué dans une maladie du système nerveux / blessures 12,14,15. Par exemple, suite à une blessure de la moelle épinière, les axones sectionnés doivent ensuite remodeler et former de nouvelles synapses pour atteindre fonctionnelle 16-19 de récupération.
nt "> émergents comme un aspect important de la plasticité synaptique est le processus de phagocytose ou l'engloutissement des synapses destinés à l'élimination 3,5,20. Nous avons récemment montré ce phénomène dans le contexte de l'élagage synaptique dans le, cerveau de souris postnatale sain 7. précisément , les microglies, les cellules résidentes et les phagocytes immunitaires du système nerveux central, ont été présentés à engloutir entrées synaptiques au cours d'une période de pointe et dans une région de la taille synaptique développement, la dorsale postnatale latérale corps genouillé (dLGN) du thalamus. blocus génétique ou pharmacologique de cette immersion entraîné des déficits soutenus dans la connectivité synaptique.Dans ce protocole, nous décrivons un test fiable et hautement quantitative pour mesurer l'engloutissement de phagocyte médiation d'entrées synaptiques. Pour les besoins de cet article, ce dosage sera présentée dans le contexte du système retinogeniculate développement, qui comprend des cellules ganglionnaires de la rétine (RGC) résidant dans la rétine quiINVESTISSEMENTS présynaptiques à la dLGN (figure 1A). Pour commencer, une stratégie d'étiquetage antérograde résistant à la dégradation lysosomale sera décrite, qui est utilisé pour visualiser les entrées synaptiques RGC-spécifiques dans le dLGN (Figure 1) 7,21. Après cette description, une méthodologie détaillée pour l'imagerie et la mesure quantitative de l'engloutissement utilisant la microscopie confocale combinée à 3 dimensions (3D) surface rendu de volume sera donnée. Cette méthodologie est basée sur la préparation de tissu fixe mais peut aussi être adaptée pour être utilisée dans des études d'imagerie en direct. Fait important, alors que le dosage a été validé dans le contexte du système de retinogeniculate sain, postnatal, on pourrait appliquer les mêmes techniques pour évaluer d'autres interactions phagocyte des neurones dans tout le cerveau et pendant la maladie, ainsi que la fonction des phagocytes dans les autres systèmes de l'organisme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afin de mesurer avec précision la phagocytose, matériel englouti doit être étiqueté de manière à ce que le chercheur peut visualiser une fois la dégradation lysosomale s'est produite. En outre, l'imagerie haute résolution est nécessaire, suivie par l'utilisation d'un logiciel qui va permettre au chercheur de visualiser le volume de la cellule entière et quantifier son contenu. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode très fiable et quantitative pour mesurer l'engloutissement de pha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de la famille Smith (BS), Dana Foundation (BS), John Scholars Program Merck (BS), NINDS (RO1-NS-07100801, BS), NRSA (F32-NS-066 698; DPS), Nancy Fondation Lurie Marks (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).
Materials
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
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