Охвате Анализ: Протокол для оценки взаимодействия между ЦНС фагоцитов и нейронов
Summary
Микроглия являются резидентные иммунные клетки центральной нервной системы (ЦНС) с высокой способностью фагоцитозу или поглотить материал в их внеклеточной среде. Здесь широко применимы, надежный и очень количественный анализ для визуализации и измерения микроглии-опосредованной полном охвате синаптических компонентов описан.
Abstract
Фагоцитоз представляет собой процесс, в котором клетка поглощает материал (вся клеток, частей клеток, мусора и т.д.) в окружающей его внеклеточной среде, а затем переваривает этот материал, как правило, через деградации лизосом. Микроглия являются резидентные иммунные клетки центральной нервной системы (ЦНС), чьи фагоцитарной функции была описана в широком диапазоне условий от нейродегенеративных заболеваний (например, бета-амилоид зазора при болезни Альцгеймера) для развития здорового мозга (например, синаптической обрезка) 1-6. Следующий протокол является охвате анализа разработан для визуализации и количественной микроглии-опосредованной полном охвате пресинаптических входов в развивающихся мыши системы retinogeniculate 7. В то время как этот анализ был использован для оценки функции микроглии в данном конкретном контексте, подобный подход может быть использован для оценки других фагоцитов по всему мозгу (например, астроцитов) и остальной частью тела(например, периферические макрофаги), а также другие условия, в которых происходит ремоделирование синапсов (например, повреждение головного мозга / болезнь).
Introduction
Synaptic схемы реконструировать в течение всей жизни животного. В развивающемся мозге, синапсы образуются в избытке, и должны пройти синаптическую обрезку, которая предусматривает селективное удаление подмножества синапсов а также поддержание и укрепление этих синапсов, которые остаются 8-10. Этот процесс необходим для достижения точного характеристику подключения взрослого нервной системы. У взрослых, синапсы также может быть пластик, особенно в контексте обучения и памяти. Структурные корреляты этой пластичности, как полагают, включают в себя добавление и / или ликвидации дендритных шипиков и пресинаптических бутонов 11-13. В дополнение к этим ролям в здоровой нервной системы, синаптической ремоделирования также участвует в заболевание нервной системы / травмы 12,14,15. Например, после травмы спинного мозга, отрубленные аксоны должны впоследствии реконструировать и формировать новые синапсы для достижения функционального восстановления 16-19.
нт "> Появившись как важного аспекта синаптической пластичности является процесс фагоцитоза или охвате синапсов, предназначенных для удаления 3,5,20. Недавно мы показали это явление в контексте синаптической обрезки в здоровой, послеродовой мозга мыши 7. частности , микроглии, резиденты ЦНС иммунные клетки и фагоциты, были показаны поглотить пресинаптические входы в пиковый период и в области развития синаптической обрезки, послеродовой спинной латерального коленчатого тела (dLGN) таламуса. Генетическая или фармакологическая блокада этой охвате привело к длительным дефицитом в синаптической связи.В этом протоколе, мы описываем надежный и очень количественного анализа для измерения фагоцитов опосредованного полном охвате пресинаптических входов. Для целей настоящей статьи, этот анализ будет представлен в контексте развивающегося retinogeniculate системы, которая включает ганглиозных клеток сетчатки (РГК), проживающего в сетчатке, чтопроецировать пресинаптические вклад в dLGN (рис. 1А). Для начала, лизосомального деградации устойчивых антероградная стратегия маркировка будет описано, которая используется для визуализации RGC-специфические пресинаптические входы в dLGN (рис. 1) 7,21. После этого описания, подробной методики для работы с изображениями и количественного измерения полном охвате помощью конфокальной микроскопии в сочетании с 3 мерные (3D) поверхности объема оказания будет дано. Эта методика основана на подготовку фиксированной ткани, но также могут быть адаптированы для использования в живых визуальных исследований. Важно отметить, что в то время как анализ был подтвержден в контексте здорового, послеродовой системы retinogeniculate, можно применять те же методы для оценки других взаимодействий фагоцитов-нейронов по всему мозгу и во время болезни, а также функцию фагоцитов в других органах и системах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для того, чтобы точно измерить фагоцитоз, охвачен материал должен быть помечены таким образом, что исследователь может визуализировать один раз деградация лизосомальных произошло. Кроме того, высокое разрешение изображений требуется, с последующим использованием программного обесп?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке грантов от Smith Family Foundation (BS), Дана фонда (BS), Джон Merck Ученые программы (BS), NINDS (РВЫХ1-NS-07100801; BS), НРСА (F32-NS-066 698; DPS), Нэнси Лурье Marks Foundation (ДПС), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC изображений фаза).
Materials
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
- Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
- Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
- Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
- Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
- Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
- Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
- Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer’s disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
- Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
- Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington’s disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
- Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
- Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
- Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).
