Nanomanipulation de molécules d'ARN simple par pinces optiques

Summary

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Abstract

Une grande partie du génome humain est transcrit mais non traduit. Dans cette ère de la génomique de poste, les fonctions de réglementation de l'ARN a été démontré que de plus en plus importante. En fonction de l'ARN est souvent fonction de sa capacité à adopter des structures alternatives, il est difficile de prédire l'ARN structures tridimensionnelles directement à partir de la séquence. Seule molécule approches montrent potentiels pour résoudre le problème de l'ARN polymorphisme structural par le suivi des structures moléculaires d'une molécule à la fois. Ce produit présente une méthode pour manipuler précisément le pliage et la structure de molécules d'ARN simple à l'aide de pinces optiques. Tout d'abord, les méthodes pour synthétiser des molécules convenant à une seule molécule travail mécanique sont décrits. , Diverses procédures d'étalonnage Suivant pour assurer les opérations propres des pinces optiques sont discutées. Ensuite, diverses expériences sont expliquées. Pour démontrer l'utilité de la technique, les résultats d'déroulent mécaniquement épingles à cheveux d'ARN et un ARN simple Kissincomplexe de g sont utilisés comme éléments de preuve. Dans ces exemples, la technique de nano-manipulation a été utilisé pour étudier le pliage de chaque domaine structural, secondaire et tertiaire, y compris, de façon indépendante. Enfin, les limitations et les futures applications du procédé sont discutées.

Introduction

Le développement de la technique des pinces optiques, a longtemps été accompagné de son application dans la recherche biologique. Lorsque l'effet de piégeage optique a été découvert, Arthur Ashkin observé que les bactéries dans l'eau contaminée pourraient être piégés au foyer laser ^1. Depuis lors, les bactéries de piégeage est devenu, une expérience amusante involontaire pour des générations d'étudiants de biophysique ainsi que d'un outil de recherche sérieuse pour étudier la physiologie microbienne ^2,3. La technique de piégeage optique utilise faisceau laser focalisé à immobiliser un objet microscopique ^1. En pratique, le fonctionnement d'un piège à laser comme un ressort optique, qui mesure également la force (F) sur l'objet emprisonné par son déplacement à partir du centre du piège (AX). Dans un court intervalle, F = κ x AX, dans κ est la constante du ressort du piège. Le piège optique peut être utilisé pour exercer une force dans picoNewton (PN) de précision à un microsobjet endoscopique et de mesurer sa position nanomètre (nm) exactitude. Dans les deux dernières décennies, les pinces optiques sont devenus l'une des techniques unique de molécules les plus utilisées en biophysique. La technique a été utilisée pour étudier le pliage et la mécanique de l'ADN ^{4-6, 7-9} ARN, protéines et ^10,11. Pinces optiques ont également été utilisés pour observer la replication de l'ADN ^{12, 13} transcription de l'ARN, et la synthèse des protéines ^14,15, ainsi que de nombreux autres événements biomoléculaires ^16-18.

Approches molécule unique sont utilisés dans la recherche de l'ARN structurel principalement à explorer le robuste paysage énergétique de pliage de l'ARN. Une séquence d'ARN peut souvent se replier en plusieurs structures stables et mutuellement exclusifs, en raison des règles simples de composition chimique et à éplucher de base d'ARN. Il est connu depuis longtemps que l'ARN polymorphisme structural, comme cela se produit dans riboswitchs ^19,20, joue un rôle important dans la régulation des gènes. A en Eurt sondage de l'ensemble du génome a révélé que les variations de température d'à peine quelques degrés influencent grandement la structure et la synthèse des protéines d'une grande partie du transcriptome cellulaire ^21. Cet exemple laisse entendre que le rôle biologique de remplacement pliage de l'ARN est peut-être plus importante et omniprésente que prévu précédemment. Polymorphisme structural, pose cependant un défi pour les approches biochimiques et biophysiques traditionnelles, qui examinent les propriétés moyennes de nombreuses molécules. Par exemple, la "marche" et conformations "off" d'un riboswitch sont mutuellement exclusifs. Une structure moyenne dérivée de structures hétérogènes n'est pas susceptible de ressembler à l'une des conformations biologiquement pertinentes. En outre, l'ARN non traduite de l'ARNm et forment généralement des structures. Leur interaction avec les protéines et les ARN régulateurs nécessite souvent déroulement de la structure existante dans le cadre de l'interaction. Par conséquent, l'étude de l'ARN dépliage / repliage devient pertinentequestion de l'ARN biologie. Pour répondre à un tel défi, l'approche unique molécule a été utilisée pour démêler l'ARN polymorphisme structural par l'étude d'une molécule à la fois ^22-27.

Par rapport à la méthode populaire de fluorescence de molécules uniques, pinces base mécanique déroulement offre un avantage que les conformations de molécules individuelles peuvent être manipulés par la force appliquée et être mesurées avec une précision nanométrique. Cette capacité de nanomanipulation peut être utilisé pour surveiller le déploiement / repliement des domaines structuraux individuels tels que le pliage d'un grand hiérarchique ARN peut être ²⁸ disséqué. En variante, un seul brin peut être dirigé pour se plier dans une de plusieurs conformères; ou une structure existante peut être induite mécaniquement à se replier en une conformation différente ^29. Dans les conditions biologiques, une structure d'ARN peut être modifié lors d'un changement de température ou la liaison du ligand. La capacité de manipulation directement s moléculairestructure ouvre un nouveau lieu d'ARN étude structurale. En principe, d'autres techniques mécaniques, telles que la microscopie à force atomique et des pinces magnétiques, peuvent également être utilisées pour étudier le pliage de molécules d'ARN simple. Cependant, ces applications sont limitées en grande partie en raison de la relativement faible résolution spatiale ^30.

L'emploi de pinces optiques permet structures d'ARN à être déployés par la force mécanique.

L'avantage de mécanique déroulement est plusieurs fois. La force peut être utilisée pour déployer la fois des structures secondaires et tertiaires, alors que les ions métalliques et ligand induit pliage se limitent principalement à des structures tertiaires. Température et dénaturant peuvent affecter de manière significative les activités de l'eau et de solutés. En revanche, force est appliquée localement pour perturber des structures moléculaires; l'effet de la force sur l'environnement est négligeable. En outre, la fusion thermique est le mieux d'étudier la thermodynamique de pliage de petites structures d'ARN,tandis que les pinces optiques ont été utilisées pour étudier les structures d'ARN avec différentes tailles, allant de un à sept paires de bases tétraboucle épingle à cheveux ²⁸ à un ribozyme ³¹ 400 nucleotides. En outre, les structures d'ARN peuvent être dépliés mécaniquement à des températures mésophiles. En revanche, les ARN de se dérouler dans une expérience de fusion thermique, la température est généralement élevée bien au-dessus des températures physiologiques, ce qui augmente considérablement l'hydrolyse de l'ARN, en particulier en présence d'ions Mg ^{2 +.}

Il est important de noter que l'effet mécanique de la force dépend de la façon dont elle est appliquée sur une structure. La force appliquée bascule le paysage énergétique de pliage. Par exemple, lorsqu'une force est appliquée sur une épingle à cheveux, les paires de bases sont brisées de façon séquentielle, un à la fois (figure 1a). La fourche de déchirure progresse en hélice le long de l'axe, qui est perpendiculaire à la force appliquée. En revanche, quand un complexe kissing minimal est sous tension, les deux n'embrassepaires de bases, qui sont parallèles à la force appliquée, la part de la force de charge (figure 1b). Les différentes géométries de l'épingle à cheveux et embrassant complexe par rapport au résultat de la force appliquée à la réponse mécanique différente, qui peut être utilisé pour distinguer pliage secondaire et tertiaire ^28,32. L'aspect théorique de la mécanique qui se déroule a déjà été examinée ^8,9,30. Ce travail décrit les approches de base pour mettre en place et exécuter un test déroulement mécanique seule molécule.

Configuration expérimentale. Dans notre expérience de traction mécanique, l'échantillon d'ARN est constituée de pinçage de l'ARN d'intérêt flanquée par deux poignées doubles brins d'ADN / ARN (figure 2) ^7. L'ensemble de la molécule peut être attaché à deux bourrelets micron de taille à revêtement de surface (Spherotech) via la streptavidine-biotine et les interactions anticorps anti-digoxigénine-digoxigénine, respectivement. Une bille est maintenue par un tr optique de mesure de forceap, tandis que l'autre se tient sur la pointe d'une micropipette. La distance relative entre les billes peut être modifiée soit par le piège de direction ou de déplacement de la micropipette. En utilisant cette approche, une molécule d'ARN simple attacher les billes peut être étiré et relâché.

Préparation des échantillons. La synthèse des échantillons d'ARN pour épilation comprend plusieurs étapes (Figure 3). Tout d'abord, la séquence d'ADN correspondant à l'ARN d'intérêt est d'abord clone dans un vecteur plasmidique. Ensuite, trois réactions de PCR sont réalisées pour produire les deux poignées et une matrice pour la transcription. Le modèle de transcription comprend les régions de la poignée et les séquences insérées. L'ARN de pleine longueur est synthétisé par transcription in vitro. Enfin, l'ARN et les poignées modifiés chimiquement sont recuites ensemble pour produire les molécules pour l'épilation.

Calibrage et le fonctionnement des pincettes. La conception de base de l'utilisation Minitweezersd dans ce travail suit celle des double faisceau pinces optiques ^33. Avec de nombreuses améliorations, les Minitweezers affichent une stabilité extraordinaire par rapport aux pinces optiques de première génération. Un certain nombre de groupes de recherche dans plusieurs pays utilisent les Minitweezers dans leur recherche de molécule unique ^14,15,34-37. Les détails de la construction, de l'étalonnage et le fonctionnement de l'appareil, y compris des vidéos d'instruction, sont disponibles sur le site Web "pincettes Lab" (http://tweezerslab.unipr.it). Ici, des améliorations et des procédures d'étalonnage qui doivent être effectuées sur des bases quotidiennes sont décrites en détail.

Protocol

1 Préparation de molécules d'ARN pour une seule molécule Tweezing Clonage de la séquence d'intérêt. Clonage de la séquence d'ADN correspondant à la structure de l'ARN dans un vecteur. Synthèse et purification de la matrice de transcription. Synthétiser un modèle de transcription par PCR. [Lieu le tableau 1 ici] Ensuite, purifier les produits de PCR en utilisant un kit de purification PCR, et concentrer l'échantillon à> 200 ng / ul. Étant donné que l'ADN puri…

Representative Results

Limité par l'espace, nanomanipulation de molécules d'ARN simple est attesté par des seuls exemples qui se déroulent mécaniques des épingles à cheveux d'ARN et un ARN avec une structure tertiaire. Manipuler simple épingle à cheveux molécules Une fois qu'une attache est établie entre les billes, et l'extension de la force sur l'attache peuvent être manipulées en utilisant un protocole défini par l'utilisate…

Discussion

Modification et dépannage dans la préparation des échantillons à la pince

Choix du vecteur de clonage. Bien que le schéma général décrit ici (figure 3) ne nécessite pas un vecteur de clonage particulier, le vecteur est préférable de ne pas avoir intrinsèque T7 ou le promoteur T3 pour la facilité de la transcription tel qu'un promoteur peut être introduit par PCR dans des positions souhaitées.

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Materials

Minitweezers	Steven B. Smith Engineering		http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card	National Instruments	USB-6351
Video card	National Instruments	PCI-1407
Labview programming software	National Instruments
NI Vision Builder	National Instruments
Laser engraver	Epilogue laser systems	Zing-16
PCR purification kit	Qiagen	28104
MEGAscript T7 kit	Life Technologies	AM1334
MEGAclear kit	Life Technologies	AM1908
Biotin-11-UTP	Thermo Fisher	FERR0081
T4 DNA polymerase	New England Labs	M0203
Streptavidin coated microsphere	Spherotech	SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere	Spherotech	DIGP-20-2
Size standard microspheres	Spherotech	PPS-6K
Kapton tape	Kaptontape.com	KPPTDE-1
No. 2 cover glass	Thermo Fisher	12-543D