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生物工程

광 핀셋으로 단일 RNA 분자의 Nanomanipulation

Published: August 20, 2014
doi:
10.3791/51542
, , ,
1Nanoscale Engineering Graduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering,University at Albany, State University of New York, 2Nanoscale Science Undergraduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering,University at Albany, State University of New York, 3Nanobioscience Constellation, College of Nanoscale Science and Engineering,University at Albany, State University of New York, 4The RNA Institute,University at Albany, State University of New York, 5Department of Biological Sciences,University at Albany, State University of New York

Summary

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Abstract

인간 게놈의 상당 부분이 전사하지만 번역되지 않습니다. 이 게시물 게놈 시대에, RNA의 규제 기능은 점점 더 중요한 것으로 나타났다. RNA의 기능은 종종 다른 구조를 채택하는 능력에 달려있다, 그것은 직접적 RNA 서열로부터 삼차원 구조를 예측하는 것은 곤란하다. 단일 분자는 한 번에 하나의 분자 구조 분자를 모니터링하여 RNA 구조 다형성의 문제를 해결하기 위해 쇼 전위에 접근한다. 이 작업은 정확하게 광 핀셋을 사용하여 단일 RNA 분자의 폴딩 구조를 조작 할 수있는 방법을 제시한다. 첫째, 방법은 단일 분자 기계 작업에 적합한 분자가 설명되어 합성합니다. 광 핀셋의 적절한 운영을 보장하기 위해 다음, 다양한 교정 절차가 설명되어 있습니다. 다음으로, 다양한 실험을 설명한다. 기술의 유틸리티를 설명하기 위해 기계적으로 전개 RNA 헤어핀의 결과와 단일 RNA 키신g 단지는 증거로 사용된다. 이러한 예에서, nanomanipulation 기술은 독립적으로, 2 차 및 3 차 구조를 포함하여 각 도메인의 폴딩을 연구하기 위해 사용되었다. 마지막으로, 한계와 방법의 미래 응용 프로그램이 논의된다.

Introduction

광 핀셋 기술의 개발은 오랫동안 생물학 연구에서의 응용 프로그램과 함께 제공하고있다. 광 포획 효과가 처음 발견되었을 때, 아서 Ashkin 오염 된 물에서 박테리아 레이저 포커스 하나에 포획 될 수 있음을 관찰 하였다. 그 이후로, 박테리아는 생물 물리학 학생들의 세대에 대한 의도하지 않은, 재미 실험뿐만 아니라 미생물 생리학 2,3를 공부하는 심각한 연구 도구가되었습니다 덫. 광 트래핑 기술은 미세 가공 대상물 (1)을 고정화 집속 레이저 빔을 사용한다. 실제로, 또한 트랩 (ΔX)의 중심으로부터 변위에 의해 포획 된 개체에 힘 (F)을 측정 광 스프링 같은 레이저 트랩 기능한다. κ 짧은 범위, F = κ X ΔX, 내 트랩의 스프링 상수이다. 트랩은 광에 마이크로 picoNewton (PN) 정밀도로 힘을가하도록 사용될 수있다copic 객체와 나노 미터 (nm의) 정확도로 위치를 측정한다. 지난 20 년 동안 광 핀셋 생물 물리학에서 가장 일반적으로 사용되는 단일 분자 기술 중 하나가되었다. 이 기술은 폴딩 및 DNA 4-6, 7-9 RNA, 단백질 10, 11의 역학을 연구하기 위해 사용되어왔다. 광 핀셋은 DNA 복제 12, RNA 전사 (13), 및 단백질 합성 14,15,뿐만 아니라 많은 다른 생체 분자 이벤트 16-18을 관찰하는데 사용되었다.

단일 분자 방법은 주로 RNA의 견고한 접이식 에너지​​ 풍경을 탐구하는 RNA 구조의 연구에 사용된다. RNA 서열은 일반적으로 인해 RNA의 간단한 화학 조성 및 기재 페어링 규칙 여러 안정한 상호 배타적 구조로 접을 수있다. 이것은 긴 RNA 구조 다형성, 즉 리보 스위치 (19, 20)에서 발생하는 등, 유전자 조절에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. recent 게놈 전체의 조사는 몇도 크게 셀룰러 사체 (21)의 큰 부분의 구조 및 단백질 합성에 영향을 작게하는 온도 변화를 밝혔다. 이 예는 이전에 생각보다 다른 RNA 폴딩의 생물학적 역할은 아마도 더 중요하고 널리 퍼져 있음을 암시한다. 구조 다형성은, 그러나, 많은 분자의 평균 속성을 검사 기존의 생화학 및 생물 물리학 적 접근 방법에 대한 도전을 포즈. 예를 들어, "을"과 riboswitch "오프"를 입체 형태는 상호 배타적입니다. 이종 구조에서 파생 된 평균 구조는 생물학적으로 관련 이형를 닮은 것 같지 않다. 또한, 번역되지 않은 RNA와 mRNA의 보통 구조를 형성한다. 단백질과 RNA를 규제와의 상호 작용은 일반적으로 상호 작용의 일환으로 기존 구조의 전개가 필요합니다. 따라서 RNA 전개 / 접힘을 공부하는 것은 해당된다RNA 생물학의 문제를 해결합니다. 이러한 과제를 해결하기 위해, 단일 분자 방법은 한 번에 22 ~ 27에 하나의 분자를 연구함으로써 RNA 구조 다형성을 해명하기 위해 사용되었습니다.

인기 단일 분자 형광 방법에 비해 기계적인 전개 기반 핀셋 개별 분자의 입체 형태는 가해진 힘에 의해 조작 될 수 있고, 나노 미터 정밀도로 측정 할 수있는 장점을 제공한다. 이 기능은 nanomanipulation 큰 RNA의 계층 폴딩 28 해부 될 수있는 개별적인 구조적 도메인의 전개 / 폴딩을 모니터하기 위해 이용 될 수있다. 대안 적으로, 단일 가닥 여러 이형태 중 하나에 접하도록 지시 할 수있다; 또는 기존의 구조가 기계적으로 서로 다른 형태 (29)에 접힘하도록 유도 될 수있다. 생물학적 조건에서 RNA 구조가 온도 변화 또는 리간드 결합시에 변경 될 수있다. 직접 조작의 분자의 능력tructure는 RNA 구조 연구의 새로운 장을 엽니 다. 원칙적으로, 예컨대 원 자간 력 현미경과 자기 핀셋과 같은 다른 기계적 방법은 또한 단일 RNA 분자의 폴딩을 연구하는데 사용될 수있다. 그러나, 이러한 애플리케이션으로 인해 상대적으로 낮은 공간 해상도 (30)에 크게 제한된다.

광 핀셋의 고용은 RNA 구조가 기계적인 힘에 의해 전개 할 수 있습니다.

전개 기계의 장점은 여러 가지다. 금속 이온과 리간드 유도 된 폴딩은 주로 차 구조로 한정되는 반면에 힘은 모두 2 차 및 3 차 구조를 전개 할 수있다. 온도 및 변성제 크게 물과 용질의 활동에 영향을 미칠 수있다. 반대로, 힘은 분자 구조를 교란하는 국소 도포; 주변 환경에의 힘의 영향은 무시할 수있다. 또한, 용융 온도가 가장 작은 RNA 구조의 접힘 열역학을 연구하는 데 사용되는,광 핀셋은 일곱베이스 쌍 tetraloop의 머리 핀의 자형으로 28에서 400 염기 라이 보자 임 (31)에 이르기까지 다양한 크기와 RNA의 구조를 연구하는 데 사용 된 반면. 또한, RNA의 구조는 기계적으로 중온 온도에서 전개 될 수있다. 대조적으로, 열 용융 실험에서의 RNA를 펼쳐, 온도는 일반적으로 상당히 잘 특히 Mg를 2 + 이온의 존재하에, RNA 가수 분해를 증가 생리적 온도 이상으로 상승된다.

그것은 힘의 기계적 효과가 구조에 적용되는 방법에 의존한다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 가해진 힘은 접는 에너지 풍경을 올라옵니다. 예를 들면, 힘이 머리핀에 적용될 때, 염기쌍 순차 시간 (도 1A)에 하나씩 세분화된다. 리핑 포크 가해진 힘에 수직 인 나선 축을 따라 진행한다. 최소한 키스 착체가 신장 상태로되면 반대로,이 키스가해진 힘에 평행 염기쌍은 힘로드를 공유 (도 1B). 2 차 및 3 차 폴딩 (28, 32)를 구별하기 위해 이용 될 수있는 서로 다른 기계적 응답에 가해진 힘의 결과로 헤어핀과 키스 복잡한 상대의 다른 형상. 전개 기계의 이론적 측면은 이전에 8,9,30을 검토하고있다. 이 작품은 설정하고 단일 분자 기계 전개 분석을 수행 할 수있는 기본적인 방법을 설명합니다.

실험 설정. 우리의 기계 당기는 실험에서, 협 지부의 RNA 샘플은 두 개의 이중 가닥 DNA / RNA 손잡이로 측면에 관심있는 RNA (그림 2)로 구성되어 7. 전체 분자는 각각-비오틴 스트렙 타비 딘과 디그 옥시 제닌 항 디곡 시게 닌 항체의 상호 작용을 통해 표면이 피복 미크론 크기의 비드 (Spherotech)에 닿는 될 수있다. 한 비드 힘 측정 광학 조원에 의해 개최됩니다AP는 다른 반면, 마이크로 피펫의 선단에 유지된다. 비드 사이의 상대 거리가 트랩 조향 또는 마이크로 피펫을 움직이는 하나에 의해 변경 될 수있다. 이 방법을 사용하여 비드를 테 더링 단일 RNA 분자는 연신 및 완화 될 수있다.

샘플의 준비. 협 지부에 대한 RNA 샘플의 합성은 몇 단계 (그림 3)를 포함한다. 먼저, 관심 RNA에 대응하는 DNA 서열은 제 플라스미드 벡터 내로 클로닝된다. 다음으로, 세 PCR 반응은 두 개의 손잡이와 전사의 템플릿을 생성하기 위해 수행된다. 전사 템플릿 핸들 영역 및 삽입 된 서열을 포함한다. 전체 길이의 RNA는 시험 관내 전사에 의해 합성된다. 마지막으로, RNA 및 화학적으로 변형 핸들은 협 지부에 대해 분자를 생성하기 위해 함께 열처리된다.

보정 및 핀셋의 작동. Minitweezers 사용의 기본적인 디자인이 작품의 D는 듀얼 빔 광 핀셋 (33)의 다음과 같습니다. 첫 번째 세대 광 핀셋에 비해 많은 개선으로, Minitweezers 특별한 안정성을 표시합니다. 여러 나라에서 연구 그룹의 숫자는 단일 분자 연구 14,15,34-37에 Minitweezers를 사용합니다. 교육 비디오를 포함하여 장치의 건설, 교정 및 운영의 세부 사항은, "족집게 연구소"웹 사이트 (http://tweezerslab.unipr.it)에서 사용할 수 있습니다. 여기서, 염기 매일 수행되어야 개선 및 교정 과정을 상세히 설명한다.

Protocol

단일 분자 협 지부에 대한 RNA 분자의 1 준비 관심 서열 복제. 벡터에 RNA 구조에 대응하는 DNA 서열을 복제. 합성 및 전사 템플릿의 정화. PCR에 의한 전사 템플릿을 합성. [여기서 도시 표 1] 다음에, PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 제품을 정제하고,> 200 NG / μL로 샘플을 집중한다. 정제 된 DNA가 전사를 위해 사용되기 때문에,의 RNase가없는 물 용출 농도 단계에 사용한다. 시험 ?…

Representative Results

공간에 의해 제한, 단일 RNA 분자의 nanomanipulation는 기계 전개 RNA 헤어핀의 예와 차 구조를 가진 RNA를 표시하여 설명된다. 단일 머리 핀 분자를 조작 테더가 비드 사이에 확립되면, 테더에 연장 및 힘은 사용자 정의 된 프로토콜을 사용하여 조작 될 수있다. 일반적인 네 개의 조작 프로토콜은 일반적으로 사용된다. 포?…

Discussion

협 지부 샘플의 준비에서 수정 및 문제 해결

클로닝 벡터의 선택. 여기에 설명 된 일반적인 구조 (도 3) 특수 클로닝 벡터를 필요로하지 않지만, 벡터는 프로모터가 원하는 위치에서 PCR을 통해 도입 될 수 있도록 전사의 용이성을 위해 고유 T7 또는 T3 프로모터를 갖지 않는 것이 바람직하다.

순서 및 핸들의 길이.</em…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.

Materials

Minitweezers Steven B. Smith Engineering http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card National Instruments USB-6351
Video card National Instruments PCI-1407
Labview programming software National Instruments
NI Vision Builder National Instruments
Laser engraver Epilogue laser systems Zing-16
PCR purification kit Qiagen 28104
MEGAscript T7 kit Life Technologies AM1334
MEGAclear kit Life Technologies AM1908
Biotin-11-UTP Thermo Fisher FERR0081
T4 DNA polymerase New England Labs M0203
Streptavidin coated microsphere Spherotech SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere Spherotech DIGP-20-2
Size standard microspheres Spherotech PPS-6K
Kapton tape Kaptontape.com KPPTDE-1
No. 2 cover glass Thermo Fisher 12-543D
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References

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Keywords: Single RNA MoleculesOptical TweezersNanomanipulationRNA StructureRNA FoldingSingle-molecule ApproachesRNA Structural PolymorphismRNA HairpinsRNA Kissing ComplexTertiary StructureSecondary Structure
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Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. X. Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (90), e51542, doi:10.3791/51542 (2014).
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